Мурин модель плода воздействия материнского воспаления для изучения последствий острого хориоамнионит на развитие кишечника новорожденных

Summary

Мы разработали модель хориоамнионит для имитации воздействия плода на воспаление матери (ФЕМИ) без осложнений живых организмов для изучения влияния ФЕМИ на развитие желудочно-кишечного тракта потомства. Это позволяет изучать механистические причины развития кишечной травмы после хориоамнионит.

Abstract

Хориоамнионит является распространенным осадком преждевременных родов и связан со многими из заболеваний недоношенных, в том числе некротизирующий энтероколит (NEC). Однако механистическая связь между этими двумя условиями еще предстоит выяснить. Мы приняли мурин модель хориоамнионит с участием липополисахарид (LPS)-индуцированного плода воздействия материнского воспаления (FEMI). Эта модель FEMI вызывает стерильный материнский, плацентарный и плода воспалительный каскад, который также присутствует во многих случаях клинического хориоамнионит. Хотя существуют модели, которые используют живые бактерии и более точно имитируют патофизиологию восходящей инфекции, приводящей к хориоамниониту, эти методы могут вызвать косвенное воздействие на развитие незрелого желудочно-кишечного тракта и связанного с ним развивающегося микробиома. Используя этот протокол, мы продемонстрировали, что ИНДУЦ, вызванный LPS FEMI, приводит к дозозависимым увеличению потери беременности и преждевременных родов, а также нарушению нормального развития кишечника у потомства. Кроме того, мы показали, что FEMI значительно увеличивает кишечные травмы и цитокины сыворотки у потомства, одновременно уменьшая кубок и клетки Панета, которые обеспечивают первую линию врожденного иммунитета против воспаления кишечника. Хотя аналогичная модель LPS-индуцированной FEMI была использована для моделирования связи между хориоамнионитом и последующими аномалиями центральной нервной системы, насколько нам известно, этот протокол является первой попыткой прояснить механистическую связь между хориоамнионитом и более поздними возмущениями в развитии кишечника в качестве потенциальной связи между хориоамнионитом и NEC.

Introduction

Хорионные мембраны играют неотъемлемую роль в беременности млекопитающих. Они включают в себя хорион и амнион, которые служат нескольким функциям. Они окружают и защищают плод, облегчают сигнализацию паракрина между материнским и фетальным^{отсеками 1}и создают локальные петли обратной связи в хорионных мембранах, которые могут быть вовлечены в инициирование партуриции^1. Текущее понимание мембран указывает на то, что амнион обеспечивает структурную барьерную функцию, а хорион обеспечивает иммунологический буфер в первую очередь для защиты развивающегося плода от материнской иммунной^{системы 2.} Воспаление этих мембран известно как хориоамнионит. Исторически, диагноз клинического хориоамнионит был сделан после наличия материнской лихорадки плюс один или несколько фетальных или материнских^{клинических выводов 3,4}. Однако, хотя это определение является клинически полезным, его отсутствие точности сделало исследования хориоамнионит сложной задачей. В 2015 году, в попытке прояснить диагноз, семинар экспертной группы Поник Кеннеди Шрайвер Национальный институт здоровья детей и развития человека определены chorioamnionitis как внутриматочное воспаление, или инфекции, или как (тройной I)³. Это разъяснение важно, потому что в то время как микробные индуцированной инфекции является важной причиной воспаления матки / амниотических, это происходит реже, чем стерильные матки / амниотические^{воспаления 5,6,7}. В целом, хориоамнионит остается значительной проблемой общественного здравоохранения, как это видно в 2’u20124% от сроков родов и 25’u201230% преждевременных^{родов 8,9}.

Хориоамнионит может иметь значительное влияние на плод и новорожденных. Это было хорошо задокументировано в литературе, что хориоамнионит связан с повышенным риском многих заболеваний недоношенности, в том числе бронхолегочных^{дисплазии 10}, повреждение головного^{мозга белого вещества 11}, внутрижелудочковое^{кровоизлияние 12}, ретинопатия^{недоношенности 13}, и как подозреваемых и подтвержденных раннего начала неонатального^{сепсиса 14,15}. Поскольку мы заинтересованы в травмах и механизмах восстановления незрелого желудочно-кишечного тракта, важно отметить, что хориоамнионит также связан с более поздним развитием некротизирующего энтероколита (NEC)^15,16. NEC является разрушительным желудочно-кишечным заболеванием недоношенных детей, что приводит к дисрегулируемой реакции хозяина на воспаление и последующий кишечный^{некроз 17}. Каждый год, NEC затрагивает более 4000 младенцев в Соединенных Штатах, и до одной трети этих младенцев умирают от болезни¹⁸. Патогенез NEC, вероятно, включает в себя сочетание кишечной незрелости, дисрегуляции незрелой иммунной системы, воспаление кишечника, и бактериальная^{транслокация 19}, кульминацией в окончательный общий путь кишечного некроза. Важно отметить, что начало NEC часто происходит через несколько недель после рождения и потенциального воздействия хориоамнионит, что делает механистическую связь между хориоамнионит и последующее развитие NEC неясно²⁰. Один потенциальный механизм, с помощью которого хориоамнионит может способствовать патофизиологии NEC через upregulation материнской иммунной системы, впоследствии производя сильный воспалительный ответ плода, которые могут нарушить нормальные модели развития плода^21,22,23.

Несколько млекопитающих модели хориоамнионит существуют у^{грызунов и овец 24,25,26,27,28,29,30,31,32}. Тем не менее, существует мало данных, касающихся развития желудочно-кишечного тракта после первоначального периода новорожденных после хориоамнионит-индуцированного плода воздействия материнского воспаления (ФЕМИ). Для того, чтобы изучить взаимосвязь между FEMI и последующего развития травмы незрелого желудочно-кишечного тракта, мы адаптировали липополисахарид (LPS) индуцированной модели FEMI. Липополисахариды являются основным компонентом внеклеточной поверхности на грамотрицательных бактерий и являются мощным стимулятором врожденной иммунной системы нескольких эукариотических видов, в том числе^{людей 33}. Материнская инъекция LPS приводит к стерильному воспалительному каскаду без путевого воздействия живых бактерий, и это устоявшаяся модель индукции преждевременных^{родов 34}, а также модель острого хориоамнионита и фетального синдрома воспалительной реакции (FIRS), который является наиболее тяжелой формой хориоамнионит^24,35. Было также показано, чтобы вызвать как церебральный белый и серый травмы^{вещества в овец модель 36} и мурин модели^37,38,39,40. Однако, насколько нам известно, мы первыми используем эту модель хориоамнионит и ФЕМИ для исследования его влияния на развитие желудочно-кишечного тракта при рождении, а также для изучения возможной механистической связи между хориоамнионитом и более поздним развитием NEC^41,42.

Protocol

Все процедуры для животных были одобрены Комитетом по институциональному уходу и использованию животных Университета Айовы (Протокол #8041401). Все животные были размещены в Ассоциации по оценке и аккредитации лабораторного ухода за животными (AALAC), утвержденной виварием в Университете А?…

Representative Results

Воздействие FEMI на эмбриональный день 15 приводит к дозозависимых потери беременности и доза зависит от скорости преждевременных родов (Рисунок 1)42. Для экспериментов, мы решили использовать дозу LPS 100 мкг/кг, чтобы свести к минимуму потерю беременности и недо?…

Discussion

Хориоамнионит влияет на 2’u20124% срока и 25’u201230% преждевременных^{родов 8,9}. Тем не менее, влияние хориоамнионит может продлить давно^{рождения,}как было показано, оказывают значительное влияние на плод^{и новорожденных 10,11,</…}

Materials

10% neutral buffered formalin	Sigma	HT501128
Alcian blue stain	Newcomer supply	1003A
C57Bl6/J mice	Jackson Laboratories	664
Ethanol	Decon labs	2701
HCl	Sigma	H1758
Hematoxylin stain	Leica	381562
LPS	Sigma	L2880
NaHCO3	Sigma	S6014
Nikon Eclipse Ni-U Microscope	Nikon	2CE-MQVJ-1
Periodic Acid	ACROS	H5106	CAS# 10450-59-9
RNAlater	Thermofisher	Am7021
Schiff's reagent	Sigma	S5133
Secor Imager 2400	Meso Scale Discovery (MSD)
V-Plex Assay	Meso Scale Discovery (MSD)
Xylene	Sigma	534056