Single Cell Collection van Trophoblast Cellen in Peri-implantatie Stage Human Embryo's
Summary
Hier beschrijven we een methode voor het opwarmen van verglaasde menselijke blastocysten, die ze in vitro door de implantatieperiode kweekt, verteren tot enkele cellen en vroege trofoblastcellen verzamelen voor verder onderzoek.
Abstract
Menselijke implantatie, de apposition en hechting aan het baarmoederoppervlak epithelia en de daaropvolgende invasie van de blastocyst in de moeder decidua, is een kritische maar raadselachtige biologische gebeurtenis die historisch moeilijk te bestuderen als gevolg van technische en ethische beperkingen. Implantatie wordt geïnitieerd door de ontwikkeling van het trophectoderm tot vroege trofoblast en de daaropvolgende differentiatie in verschillende trofoblast sublineages. Afwijkende vroege trofoblast differentiatie kan leiden tot implantatie falen, placentapathologieën, foetale afwijkingen, en miskraam. Onlangs zijn methoden ontwikkeld om menselijke embryo’s te laten groeien tot dag 13 na de bevruchting in vitro bij afwezigheid van moederweefsels, een periode die de implantatieperiode bij de mens omvat. Dit heeft onderzoekers de mogelijkheid gegeven om menselijke implantatie te onderzoeken en de dynamiek van trofoblastdifferentiatie tijdens deze kritieke periode samen te vatten zonder moederinvloeden te verwarren en inherente obstakels te vermijden om vroege embryodifferentiatiegebeurtenissen in vivo te bestuderen. Om verschillende trofoblast sublinages te karakteriseren tijdens implantatie, hebben we bestaande tweedimensionale (2D) uitgebreide kweekmethoden aangenomen en een procedure ontwikkeld om verschillende soorten trofoblastcellen enzymatisch te verteren en te isoleren voor downstream-testen. Embryo’s gekweekt in 2D-omstandigheden hebben een relatief afgeplatte morfologie en kunnen suboptimaal zijn in het modelleren in vivo driedimensionale (3D) embryonale architecturen. Echter, trofoblast differentiatie lijkt minder worden beïnvloed, zoals blijkt uit de verwachte morfologie en genexpressie veranderingen in de loop van de uitgebreide cultuur. Verschillende trofoblast sublineages, met inbegrip van cytotrophoblast, syncytiotrophoblast en trekkende trofoblast kan worden gescheiden door grootte, locatie, en temporele opkomst, en gebruikt voor verdere karakterisering of experimenten. Onderzoek van deze vroege trofoblastcellen kan een instrument zijn om menselijke implantatie te begrijpen, gemeenschappelijke placentapathologieën te behandelen en de incidentie van zwangerschapsverlies te verzachten.
Introduction
Menselijke implantatie en de opkomst van de vroege placenta zijn historisch moeilijk te onderzoeken en blijven grotendeels onbekend omdat menselijke weefsels ontoegankelijk zijn in dit stadium wanneer de zwangerschap klinisch niet op te sporen is. Diermodellen zijn ontoereikend, omdat menselijke placentatie zijn eigen unieke eigenschappen heeft in vergelijking met andere eutherische zoogdieren. Bijvoorbeeld, menselijke placenta binnendringt diep in de decidua met een aantal trofoblastcellen het bereiken van ten minste het binnenste derde van de baarmoeder myometrium, terwijl andere cellen remodelleren de baarmoeder spiraalslagaders. Zelfs onze naaste evolutionaire voorouders, de niet-menselijke primaten, vertonen verschillen in placentamorfologie en trofoblast interacties met de moederdeciduele weefsels1,,2,3. Het verkrijgen van pre-implantatie menselijke embryo’s in vitro was niet mogelijk tot in de jaren 1980 toen klinische menselijke in vitro fertilisatie (IVF) begon als een routinepraktijk voor de behandeling van onvruchtbaarheid4. Nu kunnen menselijke blastocysten in vitro worden gekweekt om de selectie van meer levensvatbare embryo’s voor overdracht mogelijk te maken, evenals veilige genetische tests mogelijk te maken. Verbetering van de embryocultuur technieken, evenals het toenemende gebruik van IVF heeft geleid tot veel overtollige blastocysten die overblijft na de behandeling van de patiënt cycli zijn voltooid. Met toestemming van de patiënt, IRB goedkeuring, en met bepaalde beperkingen, kunnen deze blastocysten worden gebruikt voor onderzoeken. Ze zijn uitgegroeid tot een onschatbare hulpbron die werden gebruikt voor de afleiding van menselijke embryonale stamcellen5, inzicht in de overgang van de innerlijke celmassa naar embryonale stamcellen6,7, en meer recentelijk, zijn met succes gekweekt tot dag (D) 13 om menselijke implantatie te verbouwen8,9. Door gebruik te maken van recent ontwikkelde eencellige omics benaderingen, heeft de toegang tot deze implantatiefase menselijke embryoweefsels unieke mogelijkheden geboden om de moleculaire mechanismen te beschrijven die dit zeer dynamische celdifferentiatieproces reguleren, dat voorheen onmogelijk was om10,11,12,13te verkennen .
Hier beschrijven we de methoden die in onze recente publicatie worden gebruikt en karakteriseren we de dynamiek van trofoblastdifferentiatie tijdens menselijke implantatie12. Dit protocol omvat de opwarming van verglaasde blastocysten, uitgebreide embryocultuur tot D12 na IVF, enzymatische vertering van het embryo in enkele cellen en celverzameling voor downstream-tests(figuur 1). Dit uitgebreide kweeksysteem ondersteunt de ontwikkeling van peri-implantatiefase menselijke embryo’s zonder maternale input en recapituleert trofoblastdifferentiatie die in overeenstemming lijkt met de waarnemingen van histologische specimens vele jaren geleden14,15,16,17. Tijdens de implantatie bestaat de trofoblastpopulatie uit ten minste twee celtypen: de mononucleated progenatorachtige cytotrophoblast (CTB) en de terminaal gedifferentieerde, multinucleated syncytiotrophoblast (STB). Bij trypsine spijsvertering, de CTB zijn kleine, ronde cellen die morfologisch niet te onderscheiden zijn van andere cellijnen (Figuur 2A, linker paneel). Scheiding van CTB van andere cellijnen, zoals epiblast en primitief endoderm, kan worden bereikt door hun verschillende transcriptomische profielen onthuld door single cell RNA sequencing. Syncytiotrophoblastcellen kunnen gemakkelijk worden geïdentificeerd als onregelmatige gevormde structuren die aanzienlijk groter zijn dan de andere celtypen en zich voornamelijk bevinden aan de periferie van het embryo(figuur 2A, middenpaneel; Figuur 2B, linkerpaneel). Trekkende trofoblastcellen (MTB) zijn een andere trofoblast sublineage gevonden tijdens embryo uitgebreide cultuur en kan worden herkend als schijnbaar weg van het hoofdlichaam van het embryo (Figuur 2A, rechter paneel, Figuur 2B, rechter paneel). Migrerende trofoblast, hoewel het uitdrukken van veel van dezelfde markers als extra villous trofoblast (EVT), mag niet worden aangeduid als EVT, omdat de villous structuren in de placenta niet zijn ontstaan in dit zeer vroege stadium van ontwikkeling.
Experimenteel konden we kleine CTB en grote STB verzamelen die gemakkelijk te onderscheiden zijn nadat embryo’s zijn verteerd tot enkele cellen bij D8, D10 en D12(figuur 2A,B). Trekkende trofoblasten ontstaan in de latere stadia van uitgebreide embryocultuur en kunnen bij D12 worden verzameld vóór enzymatische vertering van het hele embryo (figuur 2A,B). Door feotisch deze drie trofoblast sublineages te scheiden voor eencellige analyse, kunnen we specifieke transcriptomische markers identificeren en de biologische rol van elk celtype definiëren. Cytotrophoblast zijn zeer proliferative en fungeren als voorloper cellen in de levering van de STB en MTB gedifferentieerde afstammingen10,11,12,13. Syncytiotrophoblast zijn betrokken bij de productie van placentahormonen om de zwangerschap te handhaven en kan ook verantwoordelijk zijn voor de embryo’s graven in het endometrium10,11,12,13. Trekkende trofoblast heeft nog sterkere kenmerken van een invasief, migrerend fenotype en zijn waarschijnlijk verantwoordelijk voor een diepere en uitgebreidere kolonisatie van het baarmoeder- endometrium10,11,12,13. Na het definiëren van de transcriptomische handtekening van elk celtype, clustering analyses hebben ook twee extra subsets van cellen die morfologisch niet te onderscheiden van CTB en had transcriptomen met kenmerken van STB en MTB, respectievelijk12. Deze tussenstadiumcellen zijn waarschijnlijk in het proces van het differentiëren van CTB aan of de sublineages MTB of STB en zouden over het hoofd gezien zijn als de embryo’s blind werden verteerd en de cellen door transcriptoom alleen werden gescheiden.
Het hier beschreven protocol maakt gebruik van een tweedimensionaal (2D) cultuursysteem en is mogelijk niet optimaal voor het ondersteunen van driedimensionale (3D) structurele ontwikkeling, zoals wordt gesuggereerd door een recente publicatie waarin een nieuw ontwikkeld 3D-cultuursysteem13wordt beschreven. Niettemin lijkt de differentiatie van vroege trofoblast in dit 2D-systeem in overeenstemming te zijn met waarnemingen van in vivo specimens14,15,16,17. Dit protocol kan ook gemakkelijk worden aangepast voor het gebruik in het onlangs beschreven 3D-cultuursysteem13 met minimale wijzigingen. Alle stappen worden uitgevoerd met een handheld micromanipulatie pipet met commercieel verkrijgbare wegwerptips of een mondpipet van een fijn getrokken glazen pipet aan rubberen buizen, een filter en een mondstuk.
Protocol
Representative Results
Discussion
De ontwikkeling van het protocol voor de cultuur van menselijke embryo’s door middel van implantatie heeft wetenschappers in staat gesteld om een niet eerder in kaart gebrachte tijd in ontwikkeling8,9te verkennen . Hier gebruiken we een uitgebreid cultuursysteem om menselijke embryo’s te verkleven en bestuderen we vroege trofoblastdifferentiatie vóór de vorming van villous placenta. De hier beschreven methoden stellen ons in staat om verschillende TB-sublineage…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We willen graag de vele patiënten in het Colorado Center for Reproductive Medicine (CCRM) die gracieus hun embryo’s hebben gedoneerd voor onderzoek te erkennen. We willen ook Karen Maruniak en het klinisch laboratorium van CCRM bedanken voor hun hulp bij de verwerking van hCG-monsters, evenals Sue McCormick en haar klinische IVF-embryologieteam bij CCRM voor hun hulp bij het verzamelen, opslaan, volgen en doneren van embryo’s. De financiering werd intern verstrekt door CCRM.
Materials
| 3130 or 3110 Forma Series II water-jacketed CO2 incubator | Thermo Fisher Scientific | 13-998-078 | |
| 35 mm Corning Primaria tissue culture dish | VWR | 62406-038 | Case of 500 |
| 5 mL snap cap tube | VWR | 60819-295 | Pack of 25 |
| 60 mm Corning Primaria tissue culture dish | VWR | 25382-687 | Case of 200 |
| 6-well dish | Agtech Inc. | D18 | Pack of 1, 10, or 50 |
| Acidic Tyrode's solution | Millipore Sigma | T1788 | 100 mL |
| Biotix 1250 µL pipette tips | VWR | 76322-156 | Pack of 960 |
| Blast, blastocyst culture media | Origio | 83060010 | 10 mL |
| Dilution Solution | Kitazato | VT802 | 1 x 4 mL |
| Disposable Borosilicate Glass Pasteur Pipets | Thermo Fisher Scientific | 1367820D | 5.75 in. (146mm); 720/Cs |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Millipore Sigma | D8537 | |
| Embryo culture paraffin oil OvOil | Vitrolife | 10029 | 100 mL |
| Eppendorf PCR tubes 0.2 mL | VWR | 47730-598 | Pack of 1,000 |
| Eppendorf PCR tubes 0.5 mL | VWR | 89130-980 | Case of 500 |
| Fibronectin from human plasma. Liquid .1% solution | Millipore Sigma | F0895 | 1 mg |
| Gilson 1 mL Pipetteman | Thermo Fisher Scientific | F123602G | 1 Pipetteman 200-1000 µL |
| Gilson 20 µL Pipetteman | Thermo Fisher Scientific | F123602G | 1 Pipetteman 2-20 µL |
| Gilson 200 µL Pipetteman | Thermo Fisher Scientific | F123602G | 1 Pipetteman 50-200 µL |
| G-MOPS handling media | Vitrolife | 10129 | 125 mL |
| Handling media | Origio | 83100060 | 60 mL |
| Ibidi 8 well chambered coverslip | Ibidi | 80826 | 15 slides per box |
| IVC1/IVC2 | Cell Guidance Systems | M11-25/ M12-25 | 5-5mL aliquots |
| K System T47 Warming Plate | Cooper Surgical | 23054 | |
| MilliporeSigma Millex Sterile Syringe Filters with Durapore PVFD Membrane | Fisher Scientific | SLGVR33RS | Pack of 50 |
| Mouth pieces | IVF Store | MP-001-Y | 100 pieces |
| Oosafe center well dish | Oosafe | OOPW-CW05-1 | Case of 500 |
| Quinn's Advantage SPS | Origio | ART-3010 | 12x 12 mL |
| Rubber latex tubing for mouth pieces | IVF Store | IVFS-NRL-B-5 | 5 ft. |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ1270 | |
| Stripper tips | Cooper Surgical | MXL3-275 | 20/pk 275 µm |
| Thawing Solution | Kitazato | VT802 | 2 x 4 mL |
| The Stripper Micropipetter | Cooper Surgical | MXL3-STR | |
| TrypLE Express Enzyme (1X), no phenol red | Thermo Fisher Scientific | 12604013 | 1 x 100 mL |
| Tween20 | Millipore Sigma | P1379-25ML | 25 mL bottle |
| VWR 1-20 µL pipette tips | VWR | 76322-134 | Pack of 960 |
| VWR 1-200 µL pipette tips | VWR | 89174-526 | Pack of 960 |
| Washing Solution | Kitazato | VT802 | 1 x 4 mL |
References
- Carter, A. M. Animal models of human placentation–a review. Placenta. , 41-47 (2007).
- Carter, A. M., et al. Comparative placentation and animal models: patterns of trophoblast invasion — a workshop report. Placenta. 27, 30-33 (2006).
- Pijnenborg, R., Robertson, W. B., Brosens, I., Dixon, G. Review article: trophoblast invasion and the establishment of haemochorial placentation in man and laboratory animals. Placenta. 2, 71-91 (1981).
- Edwards, R. G., Bavister, B. D., Steptoe, P. C. Early stages of fertilization in vitro of human oocytes matured in vitro. Nature. 221 (5181), 632-635 (1969).
- Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).
- O’Leary, T., et al. Tracking the progression of the human inner cell mass during embryonic stem cell derivation. Nature Biotechnology. 30 (3), 278-282 (2012).
- O’Leary, T., et al. Derivation of human embryonic stem cells using a post-inner cell mass intermediate. Nature Protocols. 8 (2), 254-264 (2013).
- Shahbazi, M. N., et al. Self-organization of the human embryo in the absence of maternal tissues. Nature Cell Biology. 18 (6), 700-708 (2016).
- Deglincerti, A., et al. Self-organization of the in vitro attached human embryo. Nature. 533 (7602), 251-254 (2016).
- Zhou, F., et al. Reconstituting the transcriptome and DNA methylome landscapes of human implantation. Nature. 572 (7771), 660-664 (2019).
- Lv, B., et al. Single cell RNA sequencing reveals regulatory mechanism or trophoblast cell-fate divergence in human peri-implantation conceptuses. PLoS Biology. 17 (10), 3000187 (2019).
- West, R. C., et al. Dynamics of trophoblast differentiation in peri-implantation-stage human embryos. Proceedings of the Nationals Academy of Sciences U.S.A. 116 (45), 22635-22644 (2019).
- Xiang, L., et al. A developmental landscape of 3D-cultured human pre-gastrulation embryos. Nature. 577 (7791), 537-542 (2020).
- Mall, F. P. Report upon the collection of human embryos at the johns hopkins university. The Anatomical Record. 5 (7), 343-357 (1911).
- Buettner, K. A. Franklin Paine Mall (1862-1917). Embryo Project Encyclopedia. , (2007).
- Carnegie Institution of Washington. . Contributions to embryology. , (1915).
- Hertig, A. T., Rock, J., Adams, E. C. A description of 34 human ova within the first 17 days of development. American Journal of Anatomy. 98 (3), 435-493 (1956).
- Logsdon, D. M., Ermisch, A. F., Kile, R., Schoolcraft, W. B., Krisher, R. L. Egg cylinder development during in vitro extended embryo culture predicts the post transfer developmental potential of mouse blastocysts. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 37 (4), 747-752 (2020).
