Обнаружение фитофторы капсиди в оросительной воде с помощью loop-Mediated Isothermal Amplification
Summary
Мы разработали метод обнаружения Phytophthora capsici zoospores в источниках воды с помощью метода извлечения ДНК фильтровальной бумаги в сочетании с циклом опосредованного изотермального усиления (LAMP) анализ, который может быть проанализирован в полевых условиях или в лаборатории.
Abstract
Phytophthora capsici является разрушительным патогеном oomycete, который влияет на многие важные соланацеозные и кукурбитовые культуры, ежегодно причиняющие значительные экономические потери в производстве овощей. Phytophthora capsici является почвенной и постоянной проблемой на овощных полях из-за его долгожил структур выживания (oospores и chlamydospores), которые сопротивляются выветривания и деградации. Основным методом рассеивания является производство зооспоров, которые являются одноклеточные, флагеллированные споры, которые могут плавать через тонкие пленки воды, присутствующие на поверхностях или в заполненных водой пор почвы и может накапливаться в лужах и прудах. Таким образом, ирригационные пруды могут быть источником патогена и первоначальными точками вспышек болезней. Обнаружение P. capsici в оросительной воде трудно использовать традиционные методы, основанные на культуре, потому что другие микроорганизмы, присутствующие в окружающей среде, такие как Pythium spp., обычно перерастают P. capsici, что делает его необнаружимым. Чтобы определить наличие спор P. capsici в источниках воды (оросительная вода, сток и т.д.), мы разработали ручной насос на основе фильтровальной бумаги (8-10 мкм) метод, который захватывает споры патогена (zoospores) и позже используется для усиления ДНК патогена через новый цикл опосредованного изотермального усиления (LAMP) анализ, предназначенный для конкретного усиления P. capsici. Этот метод может усилить и обнаружить ДНК из концентрации, как низко как 1,2 х10 2 зооспоров / мл, что в 40 раз более чувствительны, чем обычные ПЦР. При тестировании близко связанных видов не было получено перекрестного усиления. LAMP также была выполнена с помощью цветометрического LAMP мастер смеси красителя, отображение результатов, которые могут быть прочитаны невооруженным глазом для быстрого обнаружения на месте. Этот протокол может быть адаптирован к другим патогенным микроорганизмам, которые обитают, накапливаются или рассредоточены через загрязненные ирригационные системы.
Introduction
Переработка воды на фермах и в детских садах становится все более популярной в связи с ростом цен на воду и экологическими проблемами, связанными с использованием воды. Для производителей было разработано множество методов орошения для сокращения распространения и возникновения болезней растений. Независимо от источника воды (орошения или осадков), сток генерируется, и многие овощеводы и питомники имеют пруд для сбора и переработки стока1. Это создает резервуар для возможного накопления патогенов в пользу распространения патогенных микроорганизмов, когда переработанная вода используется дляорошения сельскохозяйственных культур 2,,3,,4. Oomycete растительных патогенов особенно извлечь выгоду из этойпрактики,как зооспоры будут накапливаться в воде и первичной диспергаторной споры является самодвижительным, нотребует поверхностных вод 5,6,7. Phytophthora capsici является патогеном oomycete, который влияет на значительное количество соланацезных и cucurbit культур по-разному8. Часто симптомы демпфирования-офф саженцев, корнеплодов и коронки гнили; однако, в таких культурах, как огурец, тыква, дыня, тыква, арбуз, баклажаны и перец, целые урожаи могут быть потеряны из-за фруктовойгнили 9. Хотя Есть известные методы обнаружения этого патогена растений, большинство требуют инфекции уже имели место, которое слишком поздно для любых профилактических фунгицидов, чтобы иметь значительныйэффект 10.
Традиционный метод проверки оросительной воды для выявления и диагностики целевых микроорганизмов является устаревшим подходом, когда скорость и чувствительность имеют решающее значение для успеха иприбыльного производства сельскохозяйственных культур 11,,12. Ткань растений, восприимчивая к целевому патогену (например, баклажаны для P. capsici) крепится к модифицированной ловушке, которая приостанавливается в оросительном пруду в течение длительного периода времени, прежде чем быть удалены и проверены на инфекцию. Образцы из растительной ткани затем помылись на полу селективных средств массовой информации (PARPH) и инкубируется для роста культуры, то морфологическая идентификация выполняется с помощьюсоединения микроскопа 13. Есть и другие аналогичные методы обнаружения для других патогенных микроорганизмов растений с использованием селективных средств массовой информации и покрытие небольшое количество загрязненнойводы до суб-культа 14,15. Эти методы требуют от 2 до 6 недель, несколько раундов суб-культирования, чтобы изолировать организм, и опыт по фитофторы диагностики, чтобы иметь возможность распознавать ключевые морфологические символы каждого вида. Эти традиционные методы не работают хорошо для обнаружения оросительной воды, загрязненной P. capsici из-за таких факторов, как вмешательство других микроорганизмов, которые также присутствуют в источниках воды. Некоторые быстрорастущие микроорганизмы, такие как Pythium spp. и бактерии, передающие воду, могут разрастаться на пластине, делая P. capsici необнаружимым16,,17.
Целью данного исследования была разработка чувствительного и специфического молекулярного метода, который может быть использован как в полевых, так и в лабораторных условиях для обнаружения зооспоров P. capsici в оросительной воде. Протокол включает в себя разработку нового цикла опосредованного изотермального усиления (LAMP) грунтовки набор, способный специально усилить P. capsici, на основе 1121-базовой пары (bp) фрагмент P. capsici18,19. Ранее разработанная грунтовка LAMP от Dong et al. (2015) была использована по сравнению с анализом, который был разработан для этого исследования20.
Анализ LAMP является относительно новой формой молекулярного обнаружения, которая была продемонстрирована как более быстрая, чувствительная и специфичная, чем обычная полимераза цепная реакция (PCR)21. В целом, обычные анализы ПЦР не могут обнаружить менее 500 копий (1,25 пг/ОЛ); в отличие от этого, предыдущие исследования показали, что чувствительность LAMP может быть от 10 до 1000 раз выше, чем обычные ПЦР и может легко обнаружить даже 1 fg/L геномнойДНК 22,23. Кроме того, анализ может быть проведен быстро (часто в 30 мин) и на месте (в поле) с помощью портативного нагревательного блока для усиления и колоритетрического красителя, который меняет цвет для положительного образца (удаление необходимости электрофореза). В этом исследовании мы сравнили чувствительность анализов ПЦР и LAMP с помощью метода извлечения фильтра. Предлагаемый метод обнаружения позволяет исследователям и агентам расширения легко обнаружить наличие спор P. capsici из различных источников воды менее чем за два часа. Анализ оказался более чувствительным, чем обычные ПЦР и был проверен на месте, обнаружив наличие патогена в оросительной воде, используемой производителем. Этот метод обнаружения позволит производителям оценить наличие и плотность популяции патогена в различных источниках воды, которые используются для орошения, предотвращая разрушительные вспышки и экономические потери.
Protocol
Representative Results
Discussion
Тестирование оросительной воды для фитопатогенов является важным шагом для производителей, использующих ирригационные пруды и переработанную воду27. Ирригационные пруды обеспечивают водохранилище и питательную пластырь для ряда фитопатогенов, так как избыточная оросит…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа получила финансовую поддержку Грузинской товарной комиссии по овощам проекта ID’ FP00016659. Авторы благодарят д-р Pingsheng Цзи, Университет Джорджии и д-р Энн Дорранс, Университет штата Огайо за предоставление чистой культуры Phytophthora spp. Мы также благодарим Ли Ван и Делорис Вени за их техническую помощь на протяжении всего исследования.
Materials
| Agarose gel powder | Thomas Scientific | C997J85 | |
| Buchner funnel | Southern Labware | JBF003 | |
| Bullet Blender | Next Advance | BBX24 | |
| Centrifuge 5430 | Eppendorf | 22620509 | |
| Chloroform | Fischer Scientific | C298-500 | |
| CTAB solution | Biosciences | 786-565 | |
| Dneasy Extraction Kit | Qiagen | 69104 | |
| Filter Flask | United | FHFL1000 | |
| Filter Paper | United Scientific Supplies | FPR009 | |
| Gel Green 10000X | Thomas Scientific | B003B68 (1/EA) | |
| Genie III | OptiGene | ||
| Hand pump | Thomas Scientific | 1163B06 | |
| Iso-amyl Alcohol | Fischer Scientific | BP1150-500 | |
| LAVA LAMP master mix | Lucigen | 30086-1 | |
| Magnetic bead DNA extraction | Genesig | genesigEASY-EK | |
| Magnetic Separator | Genesig | genesigEASY-MR | |
| polyvinylpyrrolidone | Sigma Aldrich | PVP40-500G | |
| Primers | Sigma Aldrich | ||
| Prism Mini Centrifuge | Labnet | C1801 | |
| T100 Thermal Cycler | Bio-Rad | 1861096 | |
| UV Gel Doc | Analytik Jena | 849-00502-2 | |
| Warmstart Colorimetric Dye | Lucigen | E1800m | |
| Wide Mini ReadySub-Cell GT Cell | Bio-Rad | 1704489EDU | |
| 70% isopropanol | Fischer Scientific | A451-1 |
References
- Hong, C., Moorman, G. J. Plant pathogens in irrigation water: challenges and opportunities. Critical Reviews in Plant Sciences. 24 (3), 189-208 (2005).
- Malkawi, H. I., Mohammad, M. J. Physiology, Genetics, Morphology, & Microorganisms, E. o. Survival and accumulation of microorganisms in soils irrigated with secondary treated wastewater. Journal of Basic Microbiology. 43 (1), 47-55 (2003).
- Bush, E. A., Hong, C., Stromberg, E. L. Fluctuations of Phytophthora and Pythium spp. in components of a recycling irrigation system. Plant Disease. 87 (12), 1500-1506 (2003).
- Ghimire, S. R., et al. Distribution and diversity of Phytophthora species in nursery irrigation reservoir adopting water recycling system during winter months. Journal of Phytopathology. 159 (11-12), 713-719 (2011).
- Hausbeck, M. K., Lamour, K. H. Phytophthora capsici on vegetable crops: research progress and management challenges. Plant Disease. 88 (12), 1292-1303 (2004).
- Gevens, A., Donahoo, R., Lamour, K., Hausbeck, M. Characterization of Phytophthora capsici from Michigan surface irrigation water. Phytopathology. 97 (4), 421-428 (2007).
- Thomson, S., Allen, R. Occurrence of Phytophthora species and other potential plant pathogens in recycled irrigation water. Plant Disease Reporter. 58 (10), 945-949 (1974).
- Lamour, K. H., Stam, R., Jupe, J., Huitema, E. The oomycete broad-host-range pathogen Phytophthora capsici. Journal of Molecular Plant Pathology. 13 (4), 329-337 (2012).
- Sanogo, S., Ji, P. Water management in relation to control of Phytophthora capsici in vegetable crops. Agricultural Water Management. 129, 113-119 (2013).
- Zhang, Z., Li, Y., Fan, H., Wang, Y., Zheng, X. Molecular detection of Phytophthora capsici in infected plant tissues, soil and water. Plant Pathology. 55 (6), 770-775 (2006).
- Trout, C., Ristaino, J., Madritch, M., Wangsomboondee, T. Rapid detection of Phytophthora infestans in late blight-infected potato and tomato using PCR. Plant Disease. 81 (9), 1042-1048 (1997).
- Sankaran, S., Mishra, A., Ehsani, R., Davis, C. A review of advanced techniques for detecting plant diseases. Commputers and Electronics in Agriculture. 72 (1), 1-13 (2010).
- Wang, Z., et al. Development of an improved isolation approach and simple sequence repeat markers to characterize Phytophthora capsici populations in irrigation ponds in southern Georgia. Applied and Environmental Microbiology. 75 (17), 5467-5473 (2009).
- Ali-Shtayeh, M., MacDonald, J. Occurrence of Phytophthora species in irrigation water in the Nablus area (West Bank of Jordan). Phytopathologia Mediterranea. , 143-150 (1991).
- Pringsh, P. Comparison of serological and culture plate methods for detecting species of Phytophthora, Pythium, and Rhizoctonia in ornamental plants. Plant Disease. 74 (9), 655 (1990).
- Stewart-Wade, S. M. Plant pathogens in recycled irrigation water in commercial plant nurseries and greenhouses: their detection and management. Irrigation Science. 29 (4), 267-297 (2011).
- Aragaki, M., Uchida, J. Y. Morphological distinctions between Phytophthora capsici and P. tropicalis sp. nov. Mycologia. 93 (1), 137-145 (2001).
- Tomlinson, J., Boonham, N. Potential of LAMP for detection of plant pathogens. CAB Reviews Perspectives in Agriculture Veterinary Science Nutrition and Natural Resources. 3 (066), 1-7 (2008).
- Li, P., et al. A PCR-based assay for distinguishing between A1 and A2 mating types of Phytophthora capsici. Journal of the American Society for Horticultural Science. 142 (4), 260-264 (2017).
- Dong, Z., et al. Loop-mediated isothermal amplification assay for sensitive and rapid detection of Phytophthora capsici. Canadian Journal of Plant Pathology. 37 (4), 485-494 (2015).
- Khan, M., et al. Comparative evaluation of the LAMP assay and PCR-based assays for the rapid detection of Alternaria solani. Frontiers in Microbiology. 9, 2089 (2018).
- Sowmya, N., Thakur, M., Manonmani, H. K. Rapid and simple DNA extraction method for the detection of enterotoxigenic Staphylococcus aureus directly from food samples: comparison of PCR and LAMP methods. Journal of Applied Microbiology. 113 (1), 106-113 (2012).
- Waliullah, S., et al. Comparative analysis of different molecular and serological methods for detection of Xylella fastidiosa in blueberry. PLOS ONE. 14 (9), 0221903 (2019).
- Böhm, J., et al. Real-time quantitative PCR: DNA determination in isolated spores of the mycorrhizal fungus Glomus mosseae and monitoring of Phytophthora infestans and Phytophthora citricola in their respective host plants. Journal of Phytopathology. 147, 409-416 (1999).
- Klimczak, L., Prell, H. J. C. Isolation and characterization of mitochondrial DNA of the oomycetous fungus Phytophthora infestans. Current Genetics. 8 (4), 323-326 (1984).
- Ghimire, S. R., et al. Detection of Phytophthora species in a run-off water retention basin at a commercial nursery in plant hardiness zones 7 b of Virginia in winter. Phytopathology. 96 (6), (2006).
- Feng, W., Hieno, A., Kusunoki, M., Suga, H., Kageyama, K. J. P. LAMP detection of four plant-pathogenic oomycetes and its application in lettuce fields. Plant Disease. 103 (2), 298-307 (2019).
- Aglietti, C., et al. Real-time loop-mediated isothermal amplification: an early-warning tool for quarantine plant pathogen detection. AMB Express. 9 (1), 50 (2019).
- Almasi, M. A. Development of a colorimetric loop-mediated isothermal amplification assay for the visual detection of Fusarium oxysporum f. sp. melonis. Horticultural Plant Journal. 5 (3), 129-136 (2019).
- Gill, D. J. Pathogenic Pythium from irrigation ponds. Plant Disease Reporter. 54 (12), 1077-1079 (1970).
