Прямая электроретинограмма (DC-ERG) для записи световых электрических реакций мыши Сетчатки Пигмент Эпителий
Summary
Здесь мы представляем метод записи световых электрических реакций эпителия пигмента сетчатки (RPE) у мышей с использованием метода, известного как DC-ERGs, впервые описанного Марморштейном, Пичи и его коллегами в начале 2000-х годов.
Abstract
Эпителий пигмента сетчатки (RPE) является специализированным монослой клеток, стратегически расположенных между сетчаткой и choriocapillaris, которые поддерживают общее здоровье и структурную целостность фоторецепторов. RPE поляризуется, экспонирует апсически и базально расположенные рецепторы или каналы, и выполняет векторную транспортировку воды, ионов, метаболитов и выделяет несколько цитокинов.
Неинвазивные измерения функции RPE in vivo могут быть сделаны с использованием непосредственно связанных ERG (DC-ERG). Методология, стоящая за DC-ERG, была впервые разработана Марморштейном, Пичи и его коллегами с помощью специально построенной системы записи стимуляции, а затем продемонстрирована с использованием коммерчески доступной системы. Техника DC-ERG использует стеклянные капилляры, наполненные буферным соленым раствором Хэнка (HBSS), для измерения более медленных электрических реакций RPE, вызванных изменениями концентрации в подретинном пространстве из-за активности фоторецептора. Длительный световой стимул и длина записи DC-ERG делают его уязвимым для дрейфа и шума, что приводит к низкой урожайности годных к использованию записей. Здесь мы представляем быстрый и надежный метод повышения стабильности записей при одновременном снижении шума с помощью вакуумного давления для уменьшения/устранения пузырьков, которые являются результатом выброса HBSS и держателя электрода. Кроме того, артефакты линии электропередачи затухают с помощью регуляторов напряжения/кондиционера. Мы включаем необходимые протоколы стимуляции света для коммерчески доступной системы ERG, а также скрипты для анализа компонентов DC-ERG: c-волна, быстрое колебание, световой пик и реакция. Благодаря улучшенной простоте записей и быстрому анализу рабочего процесса, этот упрощенный протокол особенно полезен для измерения возрастных изменений в функции RPE, прогрессирования заболевания, а также в оценке фармакологического вмешательства.
Introduction
Эпителий пигмента сетчатки (RPE) является монослой специализированных клеток, которые высовывает задний сегмент глаза и оказывают критические функции для поддержания гомеостазасетчатки 1. RPE поддерживает фоторецепторы путем регенерации их фотон захвата визуального пигмента в процессе, называемомвизуальный цикл 2, участвуя в диурнальный фагоцитоз пролить внешнийсегмент советы 3, и в транспортировке питательных веществ и метаболических продуктов между фоторецепторами и choriocapillaris4,5. Аномалии в функции RPE лежат в основе многочисленных заболеваний сетчатки человека, таких как возрастнаямакулярная дегенерация 6, врожденныйамауроз Лебера 7,8 и лучшая вителлиформная макулярнаядистрофия 9. Поскольку донорские ткани глаз часто трудно получить исключительно для исследовательских целей, модели животных с генетическими модификациями могут предоставить альтернативный способ изученияразвития заболеваний сетчатки 10,11. Кроме того, появление и применение технологии CRISPR cas9 теперь позволяет геномные введения (стук в) или удаления (нокаут) в простой, одношаговый процесс, превосходя ограничения предыдущих технологий таргетинга генов12. Бум доступности новых моделей мыши13 требует более эффективного протокола записи для неинвазивной оценки функции RPE.
Измерение световых электрических реакций RPE может быть достигнуто с помощью метода электроретинограммы (DC-ERG). При использовании в сочетании с обычными записями ERG, которые измеряют фоторецептор (волна) и биполярные (b-волновые)ответы клеток 14, DC-ERG может определить, как ответные свойства RPE изменения с дегенерациейсетчатки 15,16,17 или же дисфункция RPE предшествует потере фоторецептора. Этот протокол описывает метод, адаптированный из работы Marmorstein, Peachey, и коллег, которые впервые разработали метод DC-ERG16,18,19,20 и улучшает воспроизводимость и простоту использования.
Запись DC-ERG затруднена из-за длительного времени приобретения (9 мин), в течение которого любое прерывание или введение шума может осложнить интерпретацию данных. Преимущество этого нового метода заключается в том, что базовые линии достигают стабильного состояния в течение более короткого периода времени, уменьшая вероятность того, что животное пробудится преждевременно от наркоза и менее подвержено образованию пузырьков в капиллярных электродах.
Protocol
Representative Results
Discussion
Критические шаги
Хорошая запись DC-ERG требует стабильных электродов, которые свободны от пузырьков, которые создают артефакты и нежелательный дрейф, поскольку они чрезвычайно чувствительны к outgassing и изменения температуры. Очень важно, чтобы стабильный базовый у…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана интрамуральными фондами НЭИ. Авторы искренне признают д-р Шелдон Миллер за его научные рекомендации, технические консультации, и опыт в области физиологии RPE и болезней. Авторы благодарят Меган Копера и персонал по уходу за животными за управление колониями мышей, а также доктора Таруна Бансала, Раймонда Чжоу и Yuan Wang за техническую поддержку.
Materials
| Ag/AgCl (mouth) Electrode | WPI Inc | EP1 | Mouth reference electrode for mouse |
| Ceramic Tile | Sutter Instrument | CTS | Used to cut the glass capillary tube to an appropriate size |
| Cotton Tipped Cleaning Stick | Puritan Medical Products | 867-WC No Glue | To be used as a spacer to improve the fit of the electrode holder assembly |
| Electroretinogram (ERG) System | Diagnosys LLC | E3 System | Visual electrophysiology system to diagnose ophthalmic conditions in vision research and drug trials |
| Bunsen Burner | Argos Technologies | BW20002460 | Or equivlaent to shape glass under flame |
| Glass Capillary Tube (1.5 mm) | Sutter Instruments | BF150-75 | For filling with HBSS and making contact to the cornea |
| Hank’s Buffered Salt Solution (HBSS) | Thermo Fisher Scientific Inc | 14175-095 | Commercially available. Maintain at RT |
| In-Line Filter | Whatman | 6722-5001 | To protect vacuum pump from aerosols |
| Low Noise Cable for Microelectrode Holders | WPI Inc | 5372 | Suggested for improving the length and placement of the cables and electrode holder assemblies |
| Magnetic Ball Joint | WPI Inc | 500871 | For magnetically positioning the electrode holder assembly on the stage |
| MatLab | Mathworks | MatLab: For editing the analysis software | |
| Matlab Curvefit Toolbox | Mathworks | Toolbox for MatLab (only required for editing the analysis software) | |
| MatLab Compiler | Mathworks | Toolbox for MatLab (only required for editing and re-releasing the analysis software) | |
| MatLab Runtime version 9.5 | Mathworks | R2018b (9.5) | Required to run the analysis software: https://www.mathworks.com/products/compiler/matlab-runtime.html |
| Microelectrode Holders (45 degrees) | WPI Inc | MEH345-15 | For holding the capillaries |
| Needle (25 ga) | Covidien | 8881250313 | For filling the capillary tubes with HBSS |
| needle (ground) electrode | Rhythmlink | 13mm – one elctrode | Subdermal needle electrode (ground) for mouse (13mm long, 0.4mm diameter needle, 1.5m leadwire) |
| Regulator/Power Conditioner | Furman | P-1800 | Or equivalent to remove DC-offset from noise introduced through power line |
| Syringe (12 mL) | Monoject | 1181200777 | For filling the capillary tubes with HBSS |
| T-clip | Cole-Parmer | 06852-20 | For electrode holder assembly |
| Vacuum Desiccator | Bel-Art | 420120000 | Clear polycarbonate bottom & cover |
| Pharmacological treatment | |||
| Lubricant eye gel | Alcon | 0078-0429-47 | Helps lubricates corneal surface and maintain electrical contact with capillary electrodes |
| Phenylephrine Hydrochloride 2.5% | Akorn | 17478-201-15 | Short acting mydriatic eye drops (for pupil dilation) |
| Proparacaine Hydrochloride 0.5% | Akorn | 17478-263-12 | Local anesthetic for ophthalmic instillation |
| Tropicamide 0.5% | Akorn | 17478-101-12 | Short acting mydriatic eye drops (for pupil dilation) |
| Xylazine | AnaSed | sc-362949Rx | Analgesic and muscle relaxant |
| Zetamine (Ketamine HCl) | VetOne | 501072 | Anesthetic for intramuscular injections |
References
- Steinberg, R. H. Interactions between the retinal pigment epithelium and the neural retina. Documenta Ophthalmologica. 60 (4), 327-346 (1985).
- Sahu, B., Maeda, A. RPE Visual Cycle and Biochemical Phenotypes of Mutant Mouse Models. Methods in Molecular Biology. 1753, 89-102 (2018).
- Mazzoni, F., Safa, H., Finnemann, S. C. Understanding photoreceptor outer segment phagocytosis: use and utility of RPE cells in culture. Experimental Eye Resarch. 126, 51-60 (2014).
- Wimmers, S., Karl, M. O., Strauss, O. Ion channels in the RPE. Progress in Retinal Eye Research. 26 (3), 263-301 (2007).
- Gundersen, D., Orlowski, J., Rodriguez-Boulan, E. Apical polarity of Na,K-ATPase in retinal pigment epithelium is linked to a reversal of the ankyrin-fodrin submembrane cytoskeleton. Journal of Cell Biology. 112 (5), 863-872 (1991).
- Fletcher, E. L., et al. Studying age-related macular degeneration using animal models. Optometry and Vision Science. 91 (8), 878-886 (2014).
- Gu, S. M., et al. Mutations in RPE65 cause autosomal recessive childhood-onset severe retinal dystrophy. Nature Genetics. 17 (2), 194-197 (1997).
- Marlhens, F., et al. Mutations in RPE65 cause Leber’s congenital amaurosis. Nature Genetics. 17 (2), 139-141 (1997).
- Marmorstein, A. D., et al. the product of the Best vitelliform macular dystrophy gene (VMD2), localizes to the basolateral plasma membrane of the retinal pigment epithelium. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 97 (23), 12758-12763 (2000).
- Chang, B. Mouse models for studies of retinal degeneration and diseases. Methods in Molecular Biology. 935, 27-39 (2013).
- Collin, G. B., et al. Mouse Models of Inherited Retinal Degeneration with Photoreceptor Cell Loss. Cells. 9 (4), (2020).
- Shrock, E., Güell, M. CRISPR in Animals and Animal Models. Progress in Molecular Biology and Translational Science. 152, 95-114 (2017).
- Smalley, E. CRISPR mouse model boom, rat model renaissance. Nature Biotechnology. 34 (9), 893-894 (2016).
- Benchorin, G., Calton, M. A., Beaulieu, M. O., Vollrath, D. Assessment of Murine Retinal Function by Electroretinography. Bio Protocol. 7 (7), (2017).
- Zhang, C., et al. Regulation of phagolysosomal activity by miR-204 critically influences structure and function of retinal pigment epithelium/retina. Human Molecular Genetics. 28 (20), 3355-3368 (2019).
- Samuels, I. S., et al. Light-evoked responses of the retinal pigment epithelium: changes accompanying photoreceptor loss in the mouse. Journal of Neurophysiology. 104 (1), 391-402 (2010).
- Wu, J., Marmorstein, A. D., Peachey, N. S. Functional abnormalities in the retinal pigment epithelium of CFTR mutant mice. Experimental Eye Research. 83 (2), 424-428 (2006).
- Wu, J., Peachey, N. S., Marmorstein, A. D. Light-evoked responses of the mouse retinal pigment epithelium. Journal of Neurophysiology. 91 (3), 1134-1142 (2004).
- Peachey, N. S., Stanton, J. B., Marmorstein, A. D. Noninvasive recording and response characteristics of the rat dc-electroretinogram. Visual Neuroscience. 19 (6), 693-701 (2002).
- Samuels, I. S., Bell, B. A., Pereira, A., Saxon, J., Peachey, N. S. Early retinal pigment epithelium dysfunction is concomitant with hyperglycemia in mouse models of type 1 and type 2 diabetes. Journal of Neurophysiology. 113 (4), 1085-1099 (2015).
- Marmorstein, L. Y., et al. The light peak of the electroretinogram is dependent on voltage-gated calcium channels and antagonized by bestrophin (best-1). Journal of General Physiology. 127 (5), 577-589 (2006).
- Zhang, C., et al. Invest. Ophtalmol. Vis. Sci. Annual Meeting for the Association for Research in Vision and Ophthalmology. , 3568 (2017).
- Iacovelli, J., et al. Generation of Cre transgenic mice with postnatal RPE-specific ocular expression. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 52 (3), 1378-1383 (2011).
- Wang, F. E., et al. MicroRNA-204/211 alters epithelial physiology. FASEB Journal. 24 (5), 1552-1571 (2010).
- He, L., Marioutina, M., Dunaief, J. L., Marneros, A. G. Age- and gene-dosage-dependent cre-induced abnormalities in the retinal pigment epithelium. American Journal of Pathology. 184 (6), 1660-1667 (2014).
- Gallemore, R. P., Steinberg, R. H. Light-evoked modulation of basolateral membrane Cl- conductance in chick retinal pigment epithelium: the light peak and fast oscillation. Journal of Neurophysiology. 70 (4), 1669-1680 (1993).
- Blaug, S., Quinn, R., Quong, J., Jalickee, S., Miller, S. S. Retinal pigment epithelial function: a role for CFTR. Documenta Ophthalmologica. 106 (1), 43-50 (2003).
- Gallemore, R. P., Griff, E. R., Steinberg, R. H. Evidence in support of a photoreceptoral origin for the “light-peak substance”. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 29 (4), 566-571 (1988).
- Shahi, P. K., et al. Abnormal Electroretinogram after Kir7.1 Channel Suppression Suggests Role in Retinal Electrophysiology. Science Reports. 7 (1), 10651 (2017).
- Li, Y., et al. Mouse model of human RPE65 P25L hypomorph resembles wild type under normal light rearing but is fully resistant to acute light damage. Human Molecular Genetics. 24 (15), 4417-4428 (2015).
