Obtenção de osteócitos primários através do fracionamento em calvária murina de osteócitos que expressam GFP

Summary

Este protocolo descreve a dissecção neonatal da calvária de camundongos dmp1-topázio e o isolamento de osteócitos expressando a proteína verde fluorescente através da digestão e fracionamento celular, além da preparação de osteócitos para triagem celular ativada por fluorescência (FACS).

Abstract

O osteócito, antes considerado um residente passivo do osso, dada a função de bastidores de detectar a carga mecânica, agora é trazido à tona e tem sido demonstrado que tem múltiplas funções principais, como modificar ativamente a matriz extracelular e formar um órgão endócrino com o sistema lacunocanalicular que o encerra enviando mensagens para locais distantes. Devido aos métodos que tornaram possível testar o osteócito in vitro a partir do isolamento de osteócitos primários para linhagens celulares semelhantes a osteócitos, os osteócitos estão agora experimentando um interesse retumbante e uma onda de conhecimento sobre estrutura e função. Muitos aspectos da biologia dos osteócitos e da interação com outros componentes moleculares ainda precisam ser descobertos. Neste protocolo, descrevemos em detalhes o eficiente isolamento de osteócitos primários da calvária neonatal dmp1-topázio, que expressam a proteína verde fluorescente nos osteócitos, através do fracionamento celular e posterior aquisição de culturas de osteócitos primários por FACS.

Introduction

Os osteócitos são células terminalmente diferenciadas dos progenitores osteoblásticos que se incorporaram em sua matriz^secretada1. São as células mais abundantes e de vida mais longa entre as populações de células ósseas. Residem em lacunas e apresentam morfologia estrelada característica, com dendritos que se estendem através de canais denominados canalículos, formando uma extensa rede de comunicação e trocas metabólicas com o meio circundante e a superfície^óssea2. Os osteócitos coreografam tanto os osteoblastos quanto os osteoclastos na remodelação óssea, são as principais células mecanossensoriais que conferem adaptação à carga^mecânica3, estão envolvidos na homeostase do^fosfato4 e na^{mineralização da} matriz óssea5 e, juntamente com o sistema lacunocanalicular, atuam como órgão endócrino sinalizando tecidos^distantes6.

Os osteócitos situam-se dentro de uma matriz mineralizada, o que limita a acessibilidade e torna seu isolamento desafiador, dificultando a investigação in vitro. Um dos primeiros métodos de isolamento descreveu osteócitos isolados da calvária de galinha usando um anticorpo monoclonal específico para osteócitos (OB7.3)⁷ que mais tarde foi conhecido por ser a variante aviária do PHEX (PHosphate-regulating gene with homology to Endopeptidases on the X chromosome)⁸. Outros pesquisadores usaram a digestão sequencial de ossos longos de ratos 9 ou^{camundongos 10} para obter frações ricas em osteócitos nas quais a pureza dos osteócitos foi relatada em torno de 70%⁹. As limitações desse procedimento incluem a pureza sub-ótima de culturas contaminadas com outros tipos celulares além dos osteócitos e que osteócitos poderiam ser potencialmente supercultivados por outras células em cultura, uma vez que os osteócitos perderam a capacidade de se dividir. Esses desafios restringem a usabilidade de culturas de longo prazo.

Para superar essas limitações, diferentes linhagens celulares de osteócitos foram desenvolvidas. A linhagem celular MLO-Y4¹¹ e a linhagem celular MLO-A5¹² são notavelmente as linhagens celulares mais estudadas que são úteis para o estudo dos osteócitos em estágio inicial; entretanto, são menos úteis para estudar a sinalização de osteócitos maduros, pois expressam baixos níveis de esclerostina e FGF23¹³, ambos marcadores de osteócitos maduros. Outras linhagens celulares, incluindo IDG-SW3 14 e Ocy454¹⁵, expressam altos níveis de esclerostina e FGF23 e são úteis no estudo do estágio tardio dos osteócitos. As linhagens celulares mostram-se ferramentas úteis de pesquisa; No entanto, eles não vêm sem limitações, pois não representam totalmente a biologia da célula primária. Diferentes linhagens celulares representam diferentes estágios de desenvolvimento do espectro de maturidade dos osteócitos, e as linhagens celulares não conseguem representar a heterogeneidade dos osteócitos^{primários16,17}.

Para obter culturas puras de osteócitos primários, os pesquisadores aproveitaram o modelo de camundongo cre, no qual o promotor dmp1 de 8 kb é usado para conduzir a expressão da proteína fluorescente verde (GFP) em osteócitos^18,19. Camundongos transgênicos duplos (pOB-Col 2.3- GFP-ciano e DMP1-GFP-topázio) de Paic et ^al.19 e camundongos transgênicos dmp1-topázio de Nakashima et ^al.20 têm sido utilizados para obtenção de populações de osteócitos. Em que empregaram digestão sequencial e FACS de osteócitos expressando GFP para aquisição de culturas de osteócitos primários^19,20. A direção do cre no camundongo repórter dmp1 Ai9 de 10 kb, que ativa a proteína tdTomato, mostrou-se presente em osteócitos, osteoblastos, músculos e células dentro da medula óssea. O promotor dmp1 de 8 kb apresentou o mesmo padrão de expressão, mas apenas uma proporção de osteoblastos e células da medula óssea expressou a proteína, o que indica que o promotor dmp1 de 8 kb é mais^{específico21}. Apesar disso, os resultados obtidos com o promotor dmp1 de 8 kb devem ser interpretados com cautela, e os perfis de expressão gênica devem ser realizados rotineiramente usando marcadores específicos de osteócitos versus osteoblastos para garantir que a população obtida seja de pureza alta o suficiente.

Os marcadores osteoclastos OSCAR e Dcstamp foram encontrados em populações de osteócitos hematopoéticos não depletados vs. depletos, este achado levou os autores a concluir que os digestores obtidos a partir do fracionamento da calvária neonatal de 8 kb dmp1-topázio e da classificação da GFP estão contaminados com células hematopoéticas. A contaminação com células hematopoéticas poderia ter sido atenuada apertando a comporta de classificação da GFP, uma vez que as células hematopoéticas positivas para GFP apresentaram uma intensidade de GFP razoavelmente menor do que as células mesenquimais positivas para GFP (osteócitos)²².

Os métodos de estudo in vitro dos osteócitos têm contribuído para a riqueza recente de informações sobre a biologia dos osteócitos. No entanto, o isolamento de osteócitos continua sendo um procedimento trabalhoso e demorado, com baixo rendimento celular. O método descrito de digestão óssea utilizando colagenase e EDTA, muitas vezes até a fração 8²³, leva várias horas em que a viabilidade dos osteócitos é taxada. Pesquisadores relataram o uso de frações (2\u20125) para triagem celular²⁰ e mostraram que o perfil de expressão de genes associados a osteócitos versus osteoblastos confirma o sucesso do isolamento de populações de osteócitos puros20. Neste artigo, descrevemos o processo de obtenção das frações (2\u20125) e comparamos o rendimento dos osteócitos de cada fração a partir da fração 1 a 8 para determinar o retorno dos osteócitos em cada fração. Descrevemos também a dissecção da calvária de camundongos dmp1-topázio e a digestão da calvária usando colagenase e ácido etilenodiaminotetracético (EDTA), bem como a preparação de células para FACS.

Protocol

Todos os procedimentos e cuidados com os animais foram realizados de acordo com as normas e regulamentos da Universidade de Tohoku. 1. Dissecção da calvária de camundongos dmp1-topázio recém-nascidos Para este protocolo, use filhotes de 6\u20127 dias de idade de camundongos C57BL/6-Tg(Dmp1-Topaz)1Ikal/J. Eutanasiar camundongos com inalação de isoflurano a 5% e, em seguida, transferir os filhotes para etanol 70%. Transfira o filhote eutanasiado para uma placa de cultu…

Representative Results

O objetivo deste protocolo é demonstrar o processo de obtenção de culturas de osteócitos primários da calvária neonatal de camundongos dmp1-topázio através de um processo de fracionamento usando colagenase para degradar a matriz de colágeno e EDTA para quelação de cálcio, após o qual as células são preparadas para FACS para separar osteócitos de outras populações celulares. Métodos para obtenção de osteócitos primários da calvária neonatal de camundongos frequentemente …

Discussion

O primeiro osteócito isolado foi de uma galinha^{calvária 7} isolada usando (OB7.3) ou a variante aviante de PHEX; no entanto, este método é limitado pela disponibilidade de anticorpos viáveis, uma vez que anticorpos osteocito-específicos que também são espécie-específicos têm de ser fabricados. Os pesquisadores usaram uma modificação diferente do processo enzimático sequencial para obter osteócitos de ossos longos de camundongos e ratos; A pureza relatada dessas culturas foi fixada em…

Materials

BD FACSDiva software	BD Biosciences		Data aquisition and analysis
BD Falcon Tube	BD Biosciences	352235	12 x 75 mm Tube with Cell Strainer Cap, 35 μm nylon mesh.
Bovine serum albumin (BSA)	Sigma-Aldrich, MO, USA
Collagenase	Wako, Osaka, Japan	034-22363	0.2% (w/v), crude collagenase mix sourced from C. histolyticum.
EDTA	Dojindo, Kumamoto, Japan		5mM EDTA prepared with 0.1% BSA
FACSAriaTM II	BD Biosciences
Fetal bovine serum (FBS)	Biowest, Nuaillé, France
Isolation buffer			70mM NaCl, 10mM NaHCO, 60mM sorbitol, 3mM K2HPO4, 1mM CaCl2, 0.1% (w/v) BSA, 0.5% (w/v) glucose and 25 mM HEPES
Millex Sterile Filter Unit	Merck Millipore, Ireland	SLGV033RS	0.22μm
Nylon cell strainer	FALCON, NY, USA		40μm
Trypsin-EDTA	Life Technologies, NY, USA		0.5% x10. diluted to x1 in PBS
α-MEM	Wako, Osaka, Japan		Containing 10% fetal bovine serum, 100 IU/ml penicillin G, and 100 μg/ml streptomycin