Cuantificación del ADN específico de la porcino circulante en la sangre de un modelo de trasplante
Summary
En este protocolo, se diseñaron imprimaciones específicas porcinas, se construyeron fragmentos de ADN específicos de plásmidos específicos que contienen porcinos y se establecieron curvas estándar para la cuantificación. Utilizando imprimaciones específicas de especies, cpsDNA fue cuantificado por qPCR en modelos de trasplante de células de cerdo a ratón y modelos de trasplante de parches de arteria de cerdo a mono.
Abstract
La xenotrasplante es un método factible para tratar la insuficiencia orgánica. Sin embargo, cómo controlar eficazmente el rechazo inmune del xenotrasplante es un problema para los médicos e investigadores. Este manuscrito describe un método simple y eficaz para monitorear el rechazo inmune en modelos de trasplante de células de cerdo a ratón y modelos de trasplante de parches de arteria de cerdo a mono. El ADN circulante es un biomarcador potencialmente no invasivo para el daño a los órganos. En este estudio, el ADN específico del cerdo circulante (cpsDNA) fue monitoreado durante el rechazo del xenoinjerto por PCR cuantitativo en tiempo real (qPCR). En este protocolo, se diseñaron imprimaciones específicas porcinas, se construyeron fragmentos de ADN específicos de plásmidos específicos que contienen porcinos y se establecieron curvas estándar para la cuantificación. Las imprimaciones específicas de las especies se utilizaron entonces para cuantificar cpsDNA mediante qPCR en modelos de trasplante de células de cerdo a ratón y modelos de trasplante de parches de arteria de cerdo a mono. El valor de este método sugiere que se puede utilizar como un método simple, conveniente, de bajo costo y menos invasivo para monitorear el rechazo inmune del xenotrasplante.
Introduction
La insuficiencia orgánica es una de las principales causas de muerte1. El trasplante de células, tejidos y órganos es una forma eficaz de tratar la insuficiencia orgánica2. Sin embargo, la escasez de órganos donantes limita la aplicación clínica de este método3,4. Los estudios han demostrado que los cerdos pueden ser utilizados como una fuente potencial de órganos humanos para el trasplante clínico5,6. Sin embargo, el trasplante de órganos entre especies se enfrenta a un rechazo inmune peligroso. Por lo tanto, es crucial controlar el rechazo inmune del xenotrasplante. Actualmente, el monitoreo clínico del rechazo inmune depende principalmente de los signos y síntomas del paciente, así como de las pruebas de laboratorio (por ejemplo, biopsia, análisis inmunobioquímico y ultrasonido)7,8,9. Sin embargo, estos métodos de supervisión tienen muchas desventajas. Los signos y síntomas del rechazo inmune en los pacientes suelen aparecer a finales de10,lo que no es propicio para la detección temprana y la intervención temprana; biopsia tiene la desventaja de ser invasivo11, lo que no es fácil de aceptar para los pacientes; el análisis inmunobioquímico carece de sensibilidad o especificidad, y el ultrasonido es auxiliar y costoso. Por lo tanto, es urgente encontrar un método eficaz y conveniente para monitorear el rechazo inmune.
El ADN circulante es un tipo extracelular de ADN que se encuentra en la sangre. Mandel y Metais12 informaron por primera vez de la presencia de ADN circulante en la sangre periférica en 1948. En condiciones fisiológicas normales, el ADN circulante en la sangre de personas sanas es relativamente bajo al inicio. Sin embargo, en algunas patologías, como tumores, infarto de miocardio, enfermedades autoinmunes y rechazo de trasplantes, el nivel de ADN circulante en la sangre puede aumentar significativamente13,14 debido a la liberación masiva de ADN circulante causado por apoptosis y necrosis. El origen del ADN circulante se asocia con la apoptosis y la necrosis15,que son características del rechazo del xenoinjerto16.
Se ha demostrado que el ADN circulante es un biomarcador mínimamente invasivo para detectar cánceres17,18,19. La alta secuenciación a través del ADN circulante derivado de donantes es fiable para la detección del rechazo después del trasplante deórganos 20,21. Sin embargo, este método requiere una alta concentración y calidad de ADN extraído. Los requisitos de ADN, además del alto costo y el consumo de tiempo, hacen que este método no sea elegible para el uso clínico de rutina. El ADN circulante derivado del donante puede cuantificarse con precisión mediante PCR cuantitativo en tiempo real (qPCR), que es específico y sensible. Por lo tanto, cuantificar el ADN circulante porcino por qPCR es un método factible para monitorear el rechazo inmune del xenotrasplante. Esto es menos invasivo, altamente sensible y específico, de bajo costo y ahorro de tiempo. Los cerdos y los seres humanos están genéticamente separados con secuencias genómicas muy diferentes(Figura 1). Por lo tanto, el ADN porcino circulante puede ser liberado en la sangre del receptor después del trasplante de xenotrasplante debido al xeno-rechazo. CpsDNA podría ser cuantificado con precisión por qPCR con imprimaciones específicas de la especie en la sangre del receptor. Anteriormente, hemos demostrado la justificación y viabilidad de cpsDNA como biomarcador para el xenotrasplante22,23. Aquí, revelamos consejos y detalles más experimentales. El experimento consta de los pasos siguientes. En primer lugar, se diseñaron imprimaciones específicas porcinas y se aisló el ADN genómico, que se utilizó para verificar la especificidad de las imprimaciones por PCR regular. En segundo lugar, construir la curva estándar de cpsDNA y aislar cpsDNA a partir de la sangre de la muestra. Por último, el ADN específico del cerdo circulante se cuantificó utilizando qPCR.
Protocol
Representative Results
Discussion
La cuantificación del ADN circulante porcino representa un enfoque factible para monitorear el rechazo inmune del xenotrasplante. 24 encontraron que el contenido de ADN circulante derivado de donantes (ddcfDNA) en la sangre de pacientes con rechazo agudo era significativamente mayor que el de los pacientes sin rechazo. Estos estudios sugieren que el ddcfDNA puede ser un biomarcador común para monitorear el daño del injerto de órganos. En los últimos años, qPCR se ha aplicado cada vez más al…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por subvenciones del Programa Nacional de I+D clave de China (2017YFC1103704), Fundación de Ciencia y Tecnología de Shenzhen (JCYJ20170817172116272), Fondos Especiales para la Construcción de Hospitales de Alto Nivel en Guang Provincia dedong (2019), Sanming Project of Medicine en Shenzhen (SZSM201412020), Fund for High Level Medical Discipline Construction of Shenzhen (2016031638), Shenzhen Foundation of Health and Family Planning Commission (SZXJ2017021), Shenzhen Foundation of Health and Family Planning Commission (SZXJ2017021 , SZXJ2018059).
Materials
| Agarose | Biowest, Barcelona, Spain | 111860 | |
| BamHI-HF | New England Biolabs, Ipswich, Mass, USA | R3136S | |
| 1.5 mL microcentrifuge tube | Axygen Biosciences, Union City, CA, USA | MCT-150-C | |
| 0.2 mL PCR tube | Axygen Biosciences, Union City, CA, USA | PCR-02-C | |
| C57BL/6 Mice | Medical Animal Center of Guangdong Province, China | 8~10 weeks | |
| Centrifuge | Thermo Fisher Scientific, Walt- ham, MA, USA | Micro 21R | |
| 2-Log DNA Ladder | New England Biolabs, Ipswich, Mass, USA | N3200S | 0.1–10.0 kb |
| Marker I | Tiangen, Beijing, China | MD101-02 | 0.1–0.6 kb |
| DNA Mini Column(HiBind DNA Mini Columns) | Omega Bio-tek, Norcross, GA, USA | DNACOL-01 | |
| DNA loading buffer | Solarbio, Beijing, China | D1010 | |
| E.Z.N.A.Plasmid DNA Mini Kit I and E.Z.N.A. Plasmid DNA Mini Kit II | Omega Bio-tek, Norcross, GA, USA | D6942 | |
| D6943 | |||
| EcoR I | Takara Bio, Shiga, Japan | 1040S | |
| Female Bama mini pigs | BGI Ark Biotechnology, Shenzhen, China | 2~4 months | |
| Genomic DNA Extraction Kit Ⅰ | Tiangen, Beijing, China | DP304-02 | |
| SYBR Green Realtime PCR Master Mix | Toyobo, Osaka, Japan | QPK-201 | |
| Gel Doc XR | Bio-Rad, Hercules, USA | ||
| Male cynomolgus monkeys | Guangdong Landau Biotechnology, Guangzhou, China | 8 years | |
| Nucleic acid dye(Gelred) | Biotium, Fremont, USA | 42003 | |
| polymerase(Premix Taq) | Takara Bio, Shiga, Japan | RR901A | |
| pMD19-T plasmid | Takara Bio, Shiga, Japan | D102A | |
| qPCR machine | Applied Biosystems QSDx, Waltham, USA | ||
| Serum/Circulating DNA Extraction Kit | Tiangen, Beijing, China | DP339 | |
| TAE | sangon Biotech, Shanghai, China | B548101 |
References
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