Summary
Dans ce document de méthode, nous présentons une stratégie de criblage à haut débit pour identifier les composés chimiques, tels que les osmolytes, qui ont un impact significatif sur la persistance bactérienne.
Abstract
Les bactéries persistantes sont définies comme une petite sous-population de variantes phénotypiques ayant la capacité de tolérer des concentrations élevées d’antibiotiques. Ils constituent un problème de santé important, car ils ont été associés à des infections chroniques récurrentes. Bien que la dynamique stochastique et déterministe des mécanismes liés au stress soit connue pour jouer un rôle significatif dans la persistance, les mécanismes sous-jacents au passage phénotypique à/de l’état de persistance ne sont pas complètement compris. Bien que les facteurs de persistance déclenchés par les signaux environnementaux (p. ex. épuisement des sources de carbone, d’azote et d’oxygène) aient fait l’objet d’études approfondies, les effets des osmolytes sur la persistance n’ont pas encore été déterminés. À l’aide de puces à ADN (c.-à-d. 96 plaques de puits contenant divers produits chimiques), nous avons conçu une approche pour élucider les effets de divers osmolytes sur la persistance d’Escherichia coli de manière à haut débit. Cette approche est transformatrice car elle peut être facilement adaptée à d’autres réseaux de dépistage, tels que les panels de médicaments et les bibliothèques de gènes knock-out.
Introduction
Les cultures bactériennes contiennent une petite sous-population de cellules persistantes qui sont temporairement tolérantes à des niveaux anormalement élevés d’antibiotiques. Les cellules persistantes sont génétiquement identiques à leurs parents sensibles aux antibiotiques, et leur survie a été attribuée à l’inhibition transitoire de la croissance1. Les cellules persistantes ont été découvertes pour la première fois par Gladys Hobby2, mais le terme a été utilisé pour la première fois par Joseph Bigger lorsqu’il les a identifiées dans des cultures de Staphylococcus pyogenes traitées à la pénicilline3. Une étude séminale publiée par Balaban et al.4 a découvert deux types de persister : les variantes de type I qui sont principalement formées par le passage à travers la phase stationnaire, et les variantes de type II qui sont continuellement générées pendant la croissance exponentielle. Les persistants sont détectés par des tests de survie clonogènes, dans lesquels des échantillons de culture sont prélevés à divers intervalles pendant les traitements antibiotiques, lavés et plaqués sur un milieu de croissance typique pour compter les cellules survivantes qui peuvent coloniser en l’absence d’antibiotiques. L’existence de persisters dans une culture cellulaire est évaluée par une courbe de mise à mort biphasique4,5 où la décroissance exponentielle initiale indique la mort des cellules sensibles aux antibiotiques. Cependant, la tendance à tuer diminue au fil du temps, conduisant éventuellement à une région de plateau qui représente les cellules persistantes survivantes.
Les cellules persistantes ont été associées à diverses maladies telles que la tuberculose6,la mucoviscidose7,la candidose8 et les infections des voies urinaires9. Presque tous les micro-organismes testés jusqu’à présent se sont avérés pour générer des phénotypes persistants, y compris mycobacterium tuberculosishautement pathogène6, Staphylococcus aureus10, Pseudomonas aeruginosa7 et Candida albicans8. Des études récentes fournissent également des preuves de l’augmentation des mutants multirésistants dans les sous-populations persistantes11,12. Des efforts considérables dans ce domaine ont révélé que les mécanismes de persistance sont très complexes et divers; des facteurs stochastiques et déterministes associés à la réponse SOS13,14,aux espèces réactives de l’oxygène (ROS)15,aux systèmes toxine/antitoxine (TA)16,à l’autophagie ou à l’auto-digestion17 et à la réponse stricte liée au ppGpp18 sont connus pour faciliter la formation de persister.
Malgré des progrès significatifs dans la compréhension du phénotype de persistance, les effets des osmolytes sur la persistance bactérienne n’ont pas été entièrement compris. Étant donné que le maintien d’une pression osmotique optimale est une nécessité pour la croissance, le bon fonctionnement et la survie des cellules, une étude approfondie des osmolytes pourrait conduire à des cibles potentielles pour les stratégies anti-persister. Bien que laborieux, le criblage à haut débit est une approche très efficace pour identifier les métabolites et autres produits chimiques qui jouent un rôle crucial dans le phénotype de persistance19,20. Dans ce travail, nous discuterons de notre méthode publiée19, où nous avons utilisé des puces à ADN, c’est-à-dire 96 plaques de puits contenant divers osmolytes (par exemple, chlorure de sodium, urée, nitrite de sodium, nitrate de sodium, chlorure de potassium), pour identifier les osmolytes qui influencent considérablement la persistance de E. coli.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Préparation du milieu de croissance, de la solution d’ofloxacine et des stocks de cellules D’E. coli
- Milieu régulier Luria-Bertani (LB) : Ajouter 10 g/L de tryptone, 10 g/L de chlorure de sodium (NaCl) et 5 g/L d’extrait de levure dans de l’eau désionisée (DI). Stériliser le milieu par autoclavage.
- Plaques de gélose LB : Ajouter 10 g/L de tryptone, 10 g/L de NaCl, 5 g/L d’extrait de levure et 15 g/L de gélose dans de l’eau DI et stériliser le milieu par autoclavage. À la température désirée (~55 °C), verser ~30 mL de milieu de gélose dans des plaques carrées (10 x 10 cm). Sécher les assiettes et conserver à 4 °C.
- Milieu LB modifié : Ajouter 10 g/L de tryptone et 5 g/L d’extrait de levure dans de l’eau DI. Stériliser le milieu par autoclavage.
- Milieu LB modifié comprenant un osmolyte : Mélanger 2x milieu LB modifié avec une solution 2x osmolyte en volumes égaux. Pour préparer 2x milieu LB modifié, ajouter 20 g/L de tryptone et 10 g/L d’extrait de levure dans de l’eau DI et stériliser par autoclavage. Pour préparer la solution d’osmolyte 2x, dissoudre l’osmolyte d’intérêt (2x quantité) dans de l’eau DI, puis filtrer stériliser la solution.
NOTA : L’osmolyte d’intérêt et ses concentrations peuvent être déterminés à partir des tests de dépistage des puces à adn phénotypique (voir le protocole 4). Cependant, l’osmolyte testé et la concentration 2x associée peuvent être ajustés en fonction de la nature de la recherche. Par exemple, pour étudier l’impact du chlorure de sodium 1 mM, une solution d’osmolyte 2x serait une solution de chlorure de sodium 2 mM. - Solution mère d’ofloxacine (5 mg/mL) : Ajouter 5 mg de sel d’ofloxacine (OFX) dans 1 mL d’eau DI. Ajouter 10 μL d’hydroxyde de sodium 10 M pour augmenter la solubilité de l’OFX dans l’eau, puis filtrer stériliser la solution. Préparer les aliquotes et conserver à -20 °C.
REMARQUE: L’ofloxacine est un antibiotique quinolone qui a été largement utilisé pour les cellules bactériennes en croissance et non en croissance14,21. La concentration inhibitrice minimale (CMI) d’OFX pour les cellules E. coli MG1655 se situe dans la plage de 0,039 à 0,078 μg/mL19,20. Notez également que d’autres antibiotiques tels que l’ampicilline et la kanamycine sont couramment utilisés dans la recherche sur les persistants. Le choix des antibiotiques dépend de la nature de l’étude. - E. coli Stocks de cellules MG1655 : Inoculer 2 mL de milieu LB régulier avec une seule colonie dans un tube à essai de 14 mL (encchique) et faire la culture des cellules dans un agitateur orbital à 250 tr/min et 37 °C. Lorsque les cellules atteignent la phase stationnaire, mélanger 500 μL de la culture cellulaire avec 500 μL de glycérol à 50 % (stérile) dans un flacon cryogénique et conserver à -80 °C.
2. Propagation des cellules pour éliminer les persistants préexistants
- Pour préparer une culture pendant la nuit, grattez une petite quantité de cellules d’un stock de cellules congelées avec une pointe de pipette stérile (ne décongelez pas le stock de cellules de glycérol) et inoculez les cellules dans 2 mL de milieu LB modifié dans un tube à essai à bouchon cassé de 14 mL. Culturer les cellules dans un agitateur orbital à 250 rpm et 37 °C pendant 12 h.
- Première propagation
- Après 12 h, transférer 250 μL de culture pendant la nuit dans 25 mL de milieu LB modifié frais dans une fiole déconcertée de 250 mL recouverte d’une feuille d’aluminium stérile.
- Cultiver la culture cellulaire dans un agitateur orbital à 250 tr/min et à 37 °C jusqu’à ce que les cellules atteignent la phase exponentielle moyenne (DO600 = 0,5).
- Mesurer la densité optique à 600 nm (OD600)à l’aide d’un lecteur de microplaques toutes les 30 min.
- Deuxième propagation
- À600 DO = 0,5, diluer 250 μL de culture cellulaire de la première fiole dans 25 mL de milieu LB modifié frais dans une fiole déconcertée de 250 mL.
- Cultiver la deuxième culture cellulaire dans un agitateur orbital à 250 tr/min et 37 °C jusqu’à600DO = 0,5.
- Mesurer la densité optique toutes les 30 minutes.
REMARQUE: Une culture de nuit peut avoir une quantité importante de cellules persistantes4,5,22. La méthode du cycle de dilution/croissance5 décrite ci-dessus peut être utilisée pour éliminer ces persistants préexistants avant de transférer les cellules dans des puces à ADN. Leur élimination peut être validée en quantifiant les niveaux de persistance des cultures de nuit avec le dosage décrit dans le protocole 3. Cette méthode a déjà été validée dans une étude précédente19.
3. Validation de l’élimination des cellules persistantes préexistantes
- Après la deuxième multiplication (voir étape 2.3), diluer 250 μL de la culture cellulaire (DO600 = 0,5) dans 25 mL de milieu LB modifié frais dans une fiole déconcertée de 250 mL.
NOTA : Pour les témoins, diluer 250 μL de culture pendant la nuit (voir l’étape 2.1) dans 25 mL de milieu LB modifié frais dans une fiole déconcertée de 250 mL. Avant de transférer les cellules dans le ballon, la densité cellulaire de la culture de nuit doit être ajustée dans un milieu LB modifié frais pour obtenirla DO 600 = 0,5. - Ajouter 25 μL de solution mère OFX (5 mg/mL) dans la suspension cellulaire et agiter doucement le ballon pour rendre la culture d’essai homogène. La concentration finale d’OFX est de 5 μg/mL dans la culture d’essai.
- Incuber la culture d’essai dans un agitateur orbital à 250 tr/min et 37 °C.
- À chaque heure pendant le traitement (y compris 0 h, le point de temps avant l’ajout d’OFX dans la culture d’essai), transférer 1 mL de la culture d’essai du ballon dans un tube de microcentrifugation de 1,5 mL.
- Centrifuger la culture d’essai dans le tube de microcentrifugation à 17 000 x g pendant 3 min.
- Retirez soigneusement 950 μL du surnageant sans perturber la pastille cellulaire.
- Ajouter 950 μL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) dans le tube à microcentrifugation.
- Répétez les étapes de lavage 3.5-3.7 pour 3x au total jusqu’à ce que la concentration d’antibiotique soit inférieure à la concentration minimale inhibitrice (MIC).
- Après le lavage final, ressusciter la pastille cellulaire dans 100 μL de solution de PBS, ce qui donne un échantillon concentré 10 fois.
- Prendre 10 μL de la suspension cellulaire et diluer en série six fois dans 90 μL de solution de PBS à l’aide d’une plaque inférieure ronde à 96 puits.
- Repérez 10 μL de suspensions de cellules diluées sur des plaques de gélose fraîches sans antibiotiques. Pour augmenter la limite de détection, plaquez les 90 μL restants de suspension cellulaire sur une plaque de gélose fraîche.
- Incuber les plaques de gélose à 37 °C pendant 16 h, puis compter les unités formant colonies (UFC). Tenir compte des taux de dilution lors du calcul du nombre total d’UFC dans 1 mL de culture d’essai. Les courbes de mise à mort sont générées en traçant les valeurs logarithmiques de l’UFC par rapport à la durée du traitement antibiotique.
REMARQUE : Un traitement OFX de 6 h est suffisant pour obtenir une courbe de mise à mort biphasique pour les cellules E. coli 19,20. Le niveau de persistance des cellules propagées (tel que mesuré par le nombre d’UFC à 6 h) devrait être significativement inférieur à celui de la culture de nuit. Les procédures décrites dans les protocoles 2 et 3 peuvent être effectuées avec un LB régulier selon le plan de recherche.
4. Criblages de plaques de microréseaux
- Préparation de cultures de cellules de puces à ADN
- Transférer 250 μL de cellules en phase exponentielle vers 25 mL de milieu LB modifié frais dans un tube de centrifugation de 50 mL. Mélangez doucement la suspension cellulaire pour la rendre homogène.
Remarque : les cellules de phase exponentielle (OD600 = 0,5) sont obtenues à partir de la deuxième étape de propagation (voir étape 2.3). - Transférer la suspension de cellules diluées dans un réservoir stérile de 50 mL.
- À l’aide d’une pipette multicanal, transférer 150 μL de la suspension cellulaire dans chaque puits d’un microréseau, c’est-à-dire une plaque de 96 puits contenant divers osmolytes.
Remarque : les puits qui n’ont pas d’osmolytes servent de contrôles. - Couvrez la puce à ADN avec une membrane d’étanchéité perméable aux gaz.
- Incuber la plaque dans un agitateur orbital à 37 °C et 250 tr/min pendant 24 h.
NOTA : Dans le cadre de ces expériences, des plaques disponibles dans le commerce ont été utilisées, comme des puces à adn phénotypiques (PM-9 et PM-10) qui comprennent une vaste gamme d’osmolytes, de tampons de pH et d’autres produits chimiques à l’état séché à diverses concentrations. Ces puces à ADN sont dans des formats de plaque de puits demi-zone 96. Les volumes de culture doivent être ajustés en fonction du type de plaques utilisées. Les puces à ADN peuvent également être générées manuellement (voir ci-dessous).
- Transférer 250 μL de cellules en phase exponentielle vers 25 mL de milieu LB modifié frais dans un tube de centrifugation de 50 mL. Mélangez doucement la suspension cellulaire pour la rendre homogène.
- Préparation manuelle de plaques de puces à ADN
- Transférer 75 μL de solutions d’osmolyte 2x dans les puits d’une plaque de puits de 96 demi-surface.
- Transférer 500 μL de cellules en phase exponentielle vers 25 mL de milieu LB modifié 2x dans un tube à centrifuger de 50 mL. Mélangez doucement la suspension cellulaire pour la rendre homogène.
NOTA : Le taux d’inoculation a été ajusté pour être conforme au protocole de dépistage des puces à ADN décrit à la section 4.1. - Ajouter 75 μL de la suspension cellulaire dans chaque puits de la plaque de puits 96 demi-zone contenant 2x solutions d’osmolyte.
- Incuber la plaque dans un agitateur orbital à 37 °C et 250 tr/min pendant 24 h.
- Préparation de plaques d’essai de persister
- Préparer 25 mL de milieu LB modifié contenant 5 μg/mL d’OFX dans un tube centrifuge de 50 mL et transférer ce milieu dans un réservoir stérile.
- Transférer 190 μL de milieu LB modifié avec OFX du réservoir dans chaque puits d’une plaque générique à fond plat de 96 puits (plaque de dosage persistant) à l’aide d’une pipette multicanal.
- Retirez la puce à ADN du shaker (après culture pendant 24 h) et transférez 10 μL de cultures cellulaires de la puce à ADN vers les puits de la plaque d’analyse du persister, contenant du milieu LB modifié avec OFX.
- Prendre 10 μL de suspensions cellulaires de la plaque d’essai du persister et diluer en série trois fois dans 290 μL de solution de PBS à l’aide d’une plaque de puits à fond rond de 96 et d’une pipette multicanal.
- Après la dilution en série, placez 10 μL de toutes les suspensions cellulaires diluées en série sur des plaques de gélose fraîches sans antibiotiques à l’aide d’une pipette multicanal.
- Incuber la plaque d’essai du persister (préparée à l’étape 4.3.3) dans un agitateur orbital à 37 °C et 250 tr/min pendant 6 h après avoir recouvert la plaque d’une membrane d’étanchéité perméable aux gaz.
- Après 6 h d’incubation dans un agitateur, retirez la plaque de dosage du persister et répétez les étapes 4.3.4-4.3.5.
- Incuber les plaques de gélose pendant 16 h à 37 °C, puis compter les UFC. Les niveaux de CFU avant et 6 h après le traitement antibiotique permettent de calculer la fraction persistante dans chaque puits. Le dénombrement de l’UFC avant le traitement ofx aide également à évaluer les effets des osmolytes et sur la viabilité d’E. coli.
5. Validation des conditions identifiées
- Transférer 250 μL des cellules de phase exponentielle de l’étape 2.3 à 25 mL de milieu LB modifié frais contenant l’osmolyte identifié lors du criblage des puces à ADN (voir le protocole 4).
- Incuber le ballon dans un agitateur orbital à 250 tr/min et 37 °C pendant 24 h.
- Après 24 h, retirer le ballon du agitateur et transférer 250 μL de la culture cellulaire dans 25 mL de milieu LB modifié frais dans une fiole déconcertée de 250 mL.
- Ajouter 25 μL de solution mère d’OFX (5 mg/mL) dans la suspension cellulaire et agiter doucement le ballon pour rendre la culture d’essai homogène. Incuber le ballon dans un agitateur à 37 °C et 250 tr/min.
- À chaque heure pendant le traitement, transférer 1 mL de la culture d’essai du ballon dans un tube de microcentrifuge de 1,5 mL.
- Centrifuger la culture d’essai dans le tube de microcentrifugation à 17 000 x g pendant 3 min.
- Retirer 950 μL de surnageant et ajouter 950 μL de PBS.
- Répétez les étapes de lavage 5.6 et 5.7 pour 3x.
- Après le lavage final, ressusciter la pastille cellulaire dans 100 μL de solution de PBS.
- Prendre 10 μL de la suspension cellulaire et diluer en série 6x dans 90 μL de solution de PBS à l’aide d’une plaque inférieure ronde de 96 puits.
- Repérez 10 μL des suspensions de cellules diluées sur une plaque de gélose fraîche sans antibiotiques. Pour augmenter la limite de détection, plaquez les 90 μL restants de suspension cellulaire sur une plaque de gélose fraîche.
- Incuber la plaque de gélose à 37 °C pendant 16 h, puis compter les UFC.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
La figure 1 décrit notre protocole expérimental. Les expériences sur le cycle de dilution/croissance (voir protocole 2) ont été adaptées d’une étude menée par Keren et al.5 pour éliminer les persistants provenant des cultures nocturnes. La figure 2A est une image représentative des plaques de gélose utilisées pour déterminer les niveaux d’UFC des cultures cellulaires avant et après le traitement ofx. Dans ces expériences, les cellules ont été cultivées dans un milieu LB modifié avec des osmolytes dans des plaques de puits de demi-zone 96 comme décrit à l’étape 4.2. Après avoir incubé la plaque dans un agitateur orbital pendant 24 h, l’essai du persister a été réalisé à l’aide d’une plaque de puits générique à fond plat 96 (voir étape 4.3). Les osmolytes et la concentration testée ici ont été choisis sur la base de notre étude précédente19,où nous avons effectué les étapes 4.1 et 4.3 en utilisant la plaque PM-9 qui comprend divers osmolytes à différentes concentrations (chlorure de sodium, chlorure de potassium, sulfate de sodium, éthylène glycol, formate de sodium, urée, lactate de sodium, phosphate de sodium, benzoate de sodium, sulfate d’ammonium, nitrite de sodium et nitrate de sodium). La première colonne de la figure 2A montre le nombre d’UFC du groupe témoin. La deuxième colonne représente une condition où les cellules ont été cultivées dans du nitrate de sodium de 100 mM; cette condition a été précédemment trouvé pour augmenter légèrement les niveaux de persistance19. La troisième colonne représente une condition où les cellules ont été cultivées dans du nitrite de sodium de 60 mM, et cette condition s’est précédemment avérée pour diminuer de manière significative les niveaux de persistance par rapport aux contrôles19. La figure 2B est une représentation graphique des données de l’UFC obtenues à partir des plaques de gélose. La figure 2C montre les fractions persistantes des cultures cellulaires testées dans 96 plaques de puits. Pour calculer les fractions, les comptes de persister ont été normalisés aux comptes de cellules obtenus avant les traitements antibiotiques. La figure 3 montre les courbes d’arrêt biphasiques et les fractions persistantes, respectivement, pour les cultures d’essai effectuées dans des fioles déconcertées. Dans ces expériences, les cellules ont d’abord été cultivées dans 25 mL de milieu LB modifié avec les osmolytes indiqués dans des fioles déconcertées de 250 mL pendant 24 h, puis les cellules ont été transférées dans des flacons d’essai de persister pour le dénombrement des persister comme décrit dans le protocole 5.
Figure 1 : La procédure expérimentale. Les cellules d’un stock de cellules congelées ont été cultivées pendant la nuit (12 h) dans un milieu frais de LB. À 12 h, la culture pendant la nuit a été diluée (1:100) dans 25 mL de milieu LB modifié et cultivée jusqu’àDO 600= 0,5. Cette étape de propagation a été répétée deux fois. Après l’étape finale de propagation, les cellules de phase exponentielle (àDO 600= 0,5) ont été diluées (1:100) dans un milieu LB modifié frais dans une fiole déconcertée de 250 mL et un tube à centrifuger de 50 mL, respectivement. La suspension cellulaire dans la fiole déconcertée de 250 mL a été traitée avec 5 μg/mL d’OFX pour quantifier les persisters. La suspension cellulaire dans le tube à centrifuger de 50 mL a été transférée dans des puces à ADN et incubée pendant 24 h dans un agitateur orbital à 250 tr/min et 37 °C. Les cellules des puces à ADN ont ensuite été transférées sur des plaques d’essai de persister pour quantifier les persisters. Cette figure a été créée à l’aide de biorender.com. Ce chiffre a été modifié par rapport à notre précédente publication19. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2 : Expériences sur les puces à ADN. (A) Les cellules ont d’abord été cultivées dans un milieu LB modifié avec ou sans osmolytes indiqués dans une plaque de puits de demi-zone 96 pendant 24 h. Les cellules ont ensuite été transférées sur une plaque générique de puits à fond plat de 96 et traitées avec 5 μg/mL d’OFX pendant 6 h. Avant et après le traitement de 6 h, les cellules ont été diluées en série dans du PBS, plaquées sur des plaques de gélose et incubées à 37 °C pendant 16 h. Chaque condition a 8 répliques techniques. (B) des mesures de L’UFC ont été effectuées pour évaluer les effets des osmolytes sur la viabilité et la persistance des cellules, respectivement. La ligne droite indique la limite de détection (600 UFC). (C) Le graphique représente les fractions persistantes des cultures cellulaires, calculées en prenant le rapport des comptes de UFC après et avant le traitement OFX. La fraction persistante de la culture cellulaire qui contient 60 mM de nitrite de sodium n’a pas été calculée, car son niveau de persistance est inférieur à la limite de détection. Chaque point de données a été désigné par la valeur moyenne ± l’écart type, calculé à partir de 8 répétitions techniques. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3 : Expériences de validation. (A) Des cellules de phase exponentielle ont été transférées à 25 mL de milieu frais modifié de LB avec des osmolytes indiqués dans des flacons déconcertés de 250 mL et cultivées pendant 24 h. Ensuite, les cellules ont été diluées (1:100) dans des flacons déconcertés de 250 mL contenant 25 mL de milieu LB modifié et traités avec 5 μg/mL OFX pendant 6 h. Les dénombrements de l’UFC dans les cultures d’essai ont été surveillés toutes les heures pour générer des courbes d’abattage biphasiques. * indique la condition qui affecte de manière significative les niveaux de persistance OFX par rapport aux contrôles no-osmolyte (test t à variance inégale à deux queues, p<0,05). (B) Le graphique représente les fractions persistantes des cultures. Chaque point de données a été désigné par la valeur moyenne ± l’écart type, calculé à partir de 3 répétitions biologiques. Ce chiffre a été modifié par rapport à notre précédente publication19. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
L’essai de persistance à haut débit décrit ici a été mis au point pour élucider les effets de divers produits chimiques sur la persistance de E. coli. En plus des plaques de particules commerciales, les puces à ADN peuvent être construites manuellement comme décrit à l’étape 4.2. De plus, le protocole présenté ici est flexible et peut être utilisé pour filtrer d’autres puces à ADN, telles que les panneaux de médicaments et les bibliothèques cellulaires, qui sont dans 96 formats de plaques de puits. Les conditions expérimentales, y compris la phase de croissance, le taux d’inoculation et le milieu, peuvent être ajustées pour tester ces bibliothèques. Par exemple, si l’on veut examiner une bibliothèque de cellules, telle que Keio E. coli knockout collection23, ils peuvent d’abord transférer les souches de la bibliothèque à 96 plaques de puits qui incluent des médias frais, en utilisant une pipette multicanal. Une fois que les cellules atteignent la phase de croissance souhaitée (par exemple, la phase exponentielle ou stationnaire), les cellules sont ensuite transférées sur des plaques d’essai de persister comme décrit à l’étape 4.3 pour énumérer les niveaux de persistance des souches knockout. De même, cette stratégie peut être utilisée pour examiner la collection24 de E. coli Promoter (une bibliothèque de souches déclarantes fluorescentes dans 96 formats de plaques de puits) afin d’identifier les promoteurs qui sont activés par les antibiotiques. Ces promoteurs peuvent être facilement détectés en mesurant les signaux de fluorescence des souches dans les plaques de persister-assay pendant le traitement antibiotique.
Dans nos expériences, nous avons utilisé un LB modifié (sans NaCl) pour éviter tout effet supplémentaire qui pourrait résulter de NaCl, étant donné que les puces à ADN ont déjà divers osmolytes. Bien que le NaCl dans le milieu LB régulier soit connu pour être bon pour préserver l’intégrité membranaire des cellules, il a été rapporté que le NaCl dans une plage de 0-1% a un effet minimal sur la croissance cellulaire25. De plus, les résultats des essais de coloration et de persistance de l’iodure de propidium (IP) dans notre étude précédente ont montré que l’absence de NaCl n’affecte pas de manière significative l’intégrité de la membrane et la persistance des cellules E. coli 19. Cette modification a été apportée spécifiquement pour répondre aux préoccupations de notre étude et peut être modifiée en fonction de la nature de la recherche.
Nous avons également adapté une méthode développée par Keren et al.5 pour éliminer les persistants préexistants dans nos cultures cellulaires avant l’inoculation dans les puces à ADN. On sait que les persisters de type I sont générés pendant la phase stationnaire; par conséquent, l’inoculation directe des cellules des cultures de nuit dans des plaques de microréseaux transférerait un nombre important de persistants, ce qui pourrait entraver les effets des osmolytes. Avec les expériences de cycle de dilution/croissance (voir protocole 2), nous avons pu réduire significativement ces persistants préexistants issus des cultures nocturnes19. Nous notons que nous avons cultivé les cellules dans des plaques de microréseaux pendant 24 h pour pouvoir compter tous les persistants, y compris les variantes de type I qui se forment pendant la phase stationnaire en présence d’osmolytes. Cependant, ces techniques adaptées peuvent toujours être modifiées en fonction de la nature de l’étude.
Nous avons traité les cellules dans des puces à ADN avec 5 μg/mL OFX pour énumérer les persisters. Étant donné que la procédure de lavage pour éliminer l’antibiotique de 96 échantillons serait très laborieuse, les cellules après le traitement ont été diluées en série dans du PBS sans lavage (voir étape 4.2). Cette procédure a dilué la concentration d’OFX plus de 30 fois. Les suspensions de cellules diluées ont ensuite été plaquées sur des plaques de gélose sans antibiotiques où l’OFX a été encore dispersé. Nos études préliminaires où nous avons répété ces expériences avec et sans lavage ont vérifié que cette méthode de dilution en série n’affectait pas les niveaux de persistance19.
Pendant le pipetage multicanal dans 96 plaques de puits, il faut mélanger soigneusement les suspensions cellulaires pour maintenir une distribution cellulaire homogène. Pour ce faire, en fonction du volume de travail, il serait avantageux de noter le nombre minimum de pipetage nécessaire pour rendre la solution homogène. A cet effet, nous avons mené une expérience de contrôle simple où nous avons surveillé le pipetage (de haut en bas) en dispersant une molécule de colorant dans du PBS et du milieu dans les conditions étudiées ici. De plus, si vous travaillez avec des environnements plus complexes tels que des tampons de pH, nous suggérons de mesurer le pH de la culture cellulaire avant et pendant l’incubation dans un shaker car la culture cellulaire a tendance à être très alcaline (pH ≈ 8) au fil du temps. Cela peut donner une idée de la qualité ainsi que de la plage de pH du tampon utilisé. De plus, afin d’obtenir des UFC dénombrables sur les plaques de gélose à partir des essais à haut débit, certaines conditions, comme le taux d’inoculation cellulaire, l’âge des cultures et les paramètres de dilution en série (volume pbs, taux de dilution et nombre d’étapes de dilution, etc.) devraient être optimisées avant d’essayer les puces à ADN. Enfin, les résultats obtenus à partir des puces à ADN devraient être validés dans des flacons, car le volume de la culture, la surface et l’aération dans une plaque de 96 puits pourraient avoir des effets supplémentaires sur les résultats observés.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Nous tenons à remercier les membres d’Orman Lab pour leurs précieuses contributions au cours de cette étude. Cette étude a été financée par le nih/niaid K22AI125468 prix de transition de carrière et une subvention de démarrage de l’Université de Houston.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 14-ml test tube | Fisher Scientific | 14-959-1B | |
| E. coli strain MG1655 | Princeton University | Obtained from Brynildsen lab | |
| Flat-bottom 96-well plate | USA Scientific | 5665-5161 | |
| Gas permeable sealing membrane | VWR | 102097-058 | Sterilized by gamma irradiation and free of cytotoxins |
| Half-area flat-bottom 96-well plate | VWR | 82050-062 | |
| LB agar | Fisher Scientific | BP1425-2 | Molecular genetics grade |
| Ofloxacin salt | VWR | 103466-232 | HPLC ≥97.5 |
| Phenotype microarray (PM-9 and PM-10) | Biolog | N/A | PM-9 and PM-10 plates contained various osmolytes and buffers respectively |
| Round-bottom 96-well plate | USA Scientific | 5665-0161 | |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | S271-500 | Certified ACS grade |
| Sodium nitrate | Fisher Scientific | AC424345000 | ACS reagent grade |
| Sodium nitrite | Fisher Scientific | AAA186680B | 98% purity |
| Square petri dish | Fisher Scientific | FB0875711A | |
| Tryptone | Fisher Scientific | BP1421-500 | Molecular genetics grade |
| Varioskan lux multi mode microplate reader | Thermo Fisher Scientific | VLBL00D0 | Used for optical density measurement at 600 nm |
| Yeast extract | Fisher Scientific | BP1422-100 | Molecular genetics grade |
References
- Lewis, K. Persister cells, dormancy and infectious disease. Nature Reviews Microbiology. 5 (1), 48-56 (2007).
- Hobby, G. L., Meyer, K., Chaffee, E. Observations on the Mechanism of Action of Penicillin. Experimental Biology and Medicine. 50 (2), 281-285 (1942).
- Bigger, J. Treatment of staphylococcal infections with penicillin by intermittent sterilisation. The Lancet. 244 (6320), 497-500 (1944).
- Balaban, N. Q., Merrin, J., Chait, R., Kowalik, L., Leibler, S. Bacterial persistence as a phenotypic switch. Science. 305 (5690), 1622-1625 (2004).
- Keren, I., Kaldalu, N., Spoering, A., Wang, Y., Lewis, K. Persister cells and tolerance to antimicrobials. FEMS Microbiology Letters. 230 (1), 13-18 (2004).
- Keren, I., Minami, S., Rubin, E., Lewis, K. Characterization and transcriptome analysis of mycobacterium tuberculosis persisters. mBio. 2 (3), (2011).
- Mulcahy, L. R., Burns, J. L., Lory, S., Lewis, K. Emergence of Pseudomonas aeruginosa Strains Producing High Levels of Persister Cells in Patients with Cystic Fibrosis. Journal of Bacteriology. 192 (23), 6191-6199 (2010).
- LaFleur, M. D., Kumamoto, C. A., Lewis, K. Candida albicans biofilms produce antifungal-tolerant persister cells. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 50 (11), 3839-3846 (2006).
- Allison, K. R., Brynildsen, M. P., Collins, J. J. Metabolite-enabled eradication of bacterial persisters by aminoglycosides. Nature. 473 (7346), 216-220 (2011).
- Lechner, S., Lewis, K., Bertram, R. Staphylococcus aureus persisters tolerant to bactericidal antibiotics. Journal of Molecular Microbiology and Biotechnology. 22 (4), 235-244 (2012).
- Barrett, T. C., Mok, W. W. K., Murawski, A. M., Brynildsen, M. P. Enhanced antibiotic resistance development from fluoroquinolone persisters after a single exposure to antibiotic. Nature Communications. 10 (1), 1177 (2019).
- Windels, E. M., et al. Bacterial persistence promotes the evolution of antibiotic resistance by increasing survival and mutation rates. ISME Journal. 13 (5), 1239-1251 (2019).
- Dörr, T., Lewis, K., Vulić, M. SOS response induces persistence to fluoroquinolones in Escherichia coli. PLoS Genetics. 5 (12), 1000760 (2009).
- Völzing, K. G., Brynildsen, M. P. Stationary-phase persisters to ofloxacin sustain DNA damage and require repair systems only during recovery. mBio. 6 (5), (2015).
- Grant, S. S., Kaufmann, B. B., Chand, N. S., Haseley, N., Hung, D. T. Eradication of bacterial persisters with antibiotic-generated hydroxyl radicals. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (30), 12147-12152 (2012).
- Gerdes, K., Maisonneuve, E.
- Orman, M. A., Brynildsen, M. P. Inhibition of stationary phase respiration impairs persister formation in E. coli. Nature Communications. 6 (1), 7983 (2015).
- Korch, S. B., Henderson, T. A., Hill, T. M. Characterization of the hipA7 allele of Escherichia coli and evidence that high persistence is governed by (p)ppGpp synthesis. Molecular Microbiology. 50 (4), 1199-1213 (2003).
- Karki, P., Mohiuddin, S. G., Kavousi, P., Orman, M. A. Investigating the effects of osmolytes and environmental ph on bacterial persisters. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 64 (5), 02393 (2020).
- Mohiuddin, S. G., Hoang, T., Saba, A., Karki, P., Orman, M. A. Identifying Metabolic Inhibitors to Reduce Bacterial Persistence. Frontiers in Microbiology. 11, 472 (2020).
- Brooun, A., Liu, S., Lewis, K. A dose-response study of antibiotic resistance in Pseudomonas aeruginosa biofilms. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 44 (3), 640-646 (2000).
- Luidalepp, H., Jõers, A., Kaldalu, N., Tenson, T. Age of inoculum strongly influences persister frequency and can mask effects of mutations implicated in altered persistence. Journal of Bacteriology. 193 (14), 3598-3605 (2011).
- Baba, T., et al. Construction of Escherichia coli K-12 in-frame, single-gene knockout mutants: The Keio collection. Molecular Systems Biology. 2, 0008 (2006).
- Zaslaver, A., et al. A comprehensive library of fluorescent transcriptional reporters for Escherichia coli. Nature Methods. 3 (8), 623-628 (2006).
- Hajmeer, M., Ceylan, E., Marsden, J. L., Fung, D. Y. C. Impact of sodium chloride on Escherichia coli O157:H7 and Staphylococcus aureus analysed using transmission electron microscopy. Food Microbiology. 23 (5), 446-452 (2006).
