多功能Ser/Thr激酶AURKA的激活以其在Thr288上的自磷酸化为特征。依赖于FRET的荧光探针可以区分其非活性和激活状态。在这里,我们说明了探针工程的一些策略,以及快速的FRET方案,以跟踪整个有丝分裂中的激酶激活。
上皮癌通常以Ser/ Thr激酶Aurora A / AURKA的过表达为特征。AURKA是一种多功能蛋白质,在Thr288上自磷酸化时激活。AURKA丰度在有丝分裂中达到峰值,在那里它控制有丝分裂纺锤体的稳定性和保真度,以及有丝分裂的整体效率。虽然在结构水平上表征良好,但缺乏对整个细胞周期中AURKA激活的一致监测。一种可能的解决方案包括使用遗传编码的Förster共振能量转移(FRET)生物传感器,以足够的时空分辨率深入了解AURKA的自磷酸化。在这里,我们描述了一种方案,用于设计检测Thr288自身磷酸化的FRET生物传感器,以及如何在有丝分裂期间遵循这种修饰。首先,我们概述了可能的供体/受体FRET对,并展示了AURKA FRET生物传感器在哺乳动物细胞中可能的克隆和插入方法。然后,我们在定制设置上通过荧光寿命成像显微镜(FLIM)为快速FRET测量提供分步分析。但是,该协议也适用于可用的替代商业解决方案。最后,我们考虑了基于AURKA的生物传感器最合适的FRET控制,并强调了未来潜在的改进,以进一步提高该工具的灵敏度。
极光激酶 A/AURKA 是一种多功能丝氨酸/苏氨酸激酶,在整个细胞周期和不同的亚细胞区室中具有活性1。了解其广泛的时空激活在癌症中尤为重要,因为AURKA在上皮和血液系统恶性肿瘤中经常过度表达,患者对当前可用的疗法反应不佳2。
结构研究表明,AURKA经历了两个步骤才能从无活性激酶转化为活性激酶。首先,Thr288的自磷酸化改变了激酶动力学口袋的构象并激活了它3,4,5,6。该步骤增加了AURKA在人细胞和非洲爪蟾中的催化活性3,6,7,启动激酶以获得完全活性。一旦被激活,AURKA与Xklp2(TPX2)靶向蛋白的相互作用就会诱导第二次构象变化5。这种进一步的修饰使AURKA能够达到对细胞中底物的完全酶活性5,8,9,10。
近二十年来,对AURKA的激活和活性的见解主要是通过生化方法的组合获得的。这些包括在细胞或 体内 检测磷酸化的Thr288作为AURKA活化的标志,晶体学分析,以及在 体外 或纤维素激酶测定 中以 探测AURKA1的活性。然而,这些方法的时空分辨率很差或不存在,需要新的解决方案来拓宽对这两个事件动态的了解。
在过去几年中,荧光探针的发展促进了对活细胞中AURKA的监测,从而允许以更高的时空分辨率进行后续激活。迄今为止开发的AURKA最具体的传感器依赖于FRET原理(Förster共振能量转移)11 来区分非活动和有源AURKA。开发的第一个传感器是基于底物的AURKA激酶活性生物传感器。基于底物的生物传感器由给定激酶靶向磷酸化的短氨基酸序列构成,并插入供体/受体FRET对和识别磷酸化残基的结合结构域中,这有助于生物传感器的折叠以实现有效的FRET过程12。在AURKA的情况下,在CFP-YFP供体/受体对之间插入磷酸化靶向的KIF2C的14-氨基酸片段13。但是,此传感器具有一些主要缺点。首先,该探针中使用的KIF2C序列可以通过AURKA和密切相关的激酶AURKB靶向,从而降低该生物传感器的特异性。其次,传感器依靠内源性激酶进行磷酸化。因此,如果激酶的量受到限制(例如,在亚细胞区室或细胞周期阶段),则FRET效率可能无法检测到或不显着。为了克服这些限制,我们创建了一类新的AURKA传感器,称为”构象传感器”。在这些探针中,将AURKA的全长序列插入N端的供体荧光团中,并在C端插入受体荧光团中。非活性AURKA呈现”开放”构象,使激酶的N端和C端彼此远离。由于两个末端之间的距离(>10 nm),供体/受体对处于FRET的不允许配置中。相反,自磷酸化AURKA采用”闭合”构象,两个蛋白质末端和两个荧光团靠近。这被证明允许供体和受体之间的FRET,这可以使用供体寿命的变化来测量14,15。这种探头具有几个优点。首先,它们是遗传编码的,它们可以用来替代细胞中的内源性激酶。其次,它们拯救了由AURKA敲低诱导的表型,表明它们在细胞中具有功能性。第三,它们允许在不同的亚细胞区室和整个细胞周期中跟踪激酶的激活。探针在已知激酶被激活的位置(即中心体和有丝分裂纺锤体)检测到AURKA的激活,并且还参与发现线粒体16处AURKA的激活。最后,这些传感器允许基于FRET / FLIM的高内涵筛选,其中AURKA的构象变化用于鉴定新的药理学抑制剂17。
在目前的工作中,我们描述了一种可视化培养细胞中AURKA激活的过程。首先,我们将深入了解FRET的潜在荧光团对。最合适的供体/受体对的选择将根据可用的显微镜设置或特定的下游应用(如多路复用FRET18,19)进行。然后,我们提出了一个管道来探索在快速FRET / FLIM显微镜设置中选择的生物传感器的行为。该管道将从细胞培养和同步程序扩展到FLIM采集和数据分析。最后,我们将讨论该协议的潜在优势,因为生物传感器设计的类似策略可以应用于其他激酶,也可以与其他基于FRET的成像系统一起使用。
基因编码的FRET生物传感器是测量单个蛋白质或整个信号通路活化的可靠工具41。特别是,AURKA FRET生物传感器构成了探索激酶在时间和空间上的激活的优先方式。然而,在设计或优化FRET生物传感器时,某些元素值得特别注意,不仅在一般方面,而且更具体地说是AURKA。
首先,供体/受体FRET对的性质和相对位置可以适应该激酶的特定功能。在有丝分裂期间,AURKA在有丝分裂纺锤体上富集,但它存在于整个细胞周期和不同的亚细胞位置(例如,中心体,细胞核和线粒体)1,2。如果生物传感器要用于特定的隔室,如线粒体,其可以达到酸性pH值,则应选择pH不敏感的供体 – 受体FRET对作为mTurquoise2 / shadowG。此外,将FRET供体放置在C端可以更好地可视化该亚细胞室的生物传感器,并且鉴于AURKA N-末端被证明在线粒体处部分分裂,甚至可能优化FRET检测16,42。
其次,优化AURKA FRET生物传感器的一种尚未探索的方法将需要更仔细地设计全长AURKA和供体/受体对之间的连接子。不仅荧光对之间的距离,而且接头本身的性质也被证明是提高FRET效率的关键因素43,44,45,46。有鉴于此,增加连接器的刚性或柔韧性可能会损害FRET效率,或进一步提高其效率。
第三,已知AURKA的过表达会在相当大比例的细胞中诱导有丝分裂纺锤体异常2。比较通过在巨细胞病毒(CMV)等强启动子(哺乳动物表达载体中最常见的启动子之一)或AURKA最小启动子序列(CTTCCGG)下表达相同的FRET构建体获得的ΔLifetime会很有趣。该启动子先前被证明可以挽救激酶敲低后产生的单极或多极纺锤体,并且其使用本身不会诱导细胞周期扰动14,47。虽然FLIM对细胞中的蛋白质表达水平和相对浓度11不敏感,但在同一生物传感器设置上对两个启动子进行彻底比较将扩大对任何给定位置的活化AURKA池的理解。此外,它还将提供关于AURKA激活如何在过度表达时发生变化的新见解,这与上皮癌和血液学癌症范式有关。
最后,还应考虑下游的FRET应用。AURKA领域的未来前景是将激酶构象生物传感器与基于底物的生物传感器累积起来。同时分析两个生物传感器的FRET行为 – 这一过程称为多重FRET – 需要第一个生物传感器上的暗受体,以避免光谱在第二个供体通道中渗出。在AURKA的背景下,这将开辟令人兴奋的新视角,即用第一个生物传感器检测激酶的活化,以及第二个生物传感器对给定底物的酶活性。多路复用的最新发展现在允许一次累积多达三个生物传感器48。在AURKA的背景下应用类似的方法可能代表了一种非常有前途的策略,不仅可以测试激酶的激活 – 活性相互作用,还可以探索具有前所未有的时空分辨率的AURKA信号级联。
总之,FRET/FLIM是加深蛋白质活性知识的便捷方法。一方面,由于至少一个荧光部分,它允许可视化活细胞中给定蛋白质的定位。另一方面,它可以解开蛋白质构象变化,这可能为蛋白质活化和/或活性提供信息。因此,FRET / FLIM和构象FRET生物传感器有可能成为追踪活细胞信号通路的广泛方法,并具有精确的时空分辨率。
The authors have nothing to disclose.
我们感谢显微镜-雷恩成像中心(法国雷恩市BIOSIT的MRic,BIOSIT)的工程师们的建议和帮助,特别是X. Pinson对手稿的批判性阅读。MRic是法国国家研究机构(ANR-10-INBS-04)支持的国家基础设施法国生物成像的成员。这项工作得到了 国家科学研究中心 (CNRS)、国际癌症委员会、 盔甲和金融科学研究所以及癌症研究 协会(ARC) 对G.B的支持。
Alisertib (MLN8237) | SelleckChem | S1133 | Use at a 250 nM final dilution |
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | ThermoFischer Scientific Brand: Gibco |
41966052 | High glucose + L-glutamine + Sodium pyruvate |
Fetal Bovine Serum (FBS) | ThermoFischer Scientific Brand: Gibco |
10270106 | |
L15 | ThermoFischer Scientific Brand: Gibco |
21083027 | Leibovitz's L15 medium + L-glutamine, no Phenol red |
LabTek | Nunc | 2515380 | |
Nocodazole | Merck Brand: Sigma-Aldrich |
M1404 | Use at a 100 ng/mL final dilution |
Penicillin/Streptomycin | ThermoFischer Scientific Brand: Gibco |
15140122 | Penicillin-Streptomycin 10,000 U/mL (100x) |
Phosphate Buffer Saline (PBS) | ThermoFischer Scientific Brand: Gibco |
14190169 | DPBS, no calcium, no magnesium |
Trypsin/EDTA | ThermoFischer Scientific Brand: Gibco |
25300096 | Trypsin-EDTA 0.05%, Phenol Red (1x) |