Culture de tissu du cortex ovarien bovin

Summary

La culture in vitro du cortex ovarien bovin et l’effet du régime nutritionnel Stair-step sur le microenvironnement ovarien sont présentés. Des morceaux de cortex ovarien ont été cultivés pendant sept jours et les stéroïdes, les cytokines et les stades folliculaires ont été évalués. Le traitement diététique Stair-Step avait une augmentation de la stéroïdogenèse entraînant une progression des follicules en culture.

Abstract

Le développement du follicule du stade primordial au stade antral est un processus dynamique dans le cortex ovarien, qui comprend des facteurs endocriniens et paracrines des cellules somatiques et de la communication cellule-ovocyte cumulus. On sait peu de choses sur le microenvironnement ovarien et sur la façon dont les cytokines et les stéroïdes produits dans le milieu environnant affectent la progression ou l’arrêt des follicules. La culture in vitro du cortex ovarien permet aux follicules de se développer dans un environnement normalisé qui reste soutenu par le stroma adjacent. Notre objectif était de déterminer l’effet du régime nutritionnel Stair-Step sur le microenvironnement ovarien (développement de follicules, production de stéroïdes et de cytokines) par culture in vitro du cortex ovarien bovin. Pour ce faire, des morceaux corticaux ovariens ont été retirés des génisses subissant deux schémas nutritionnels différents développés avant la puberté: Control (développement nutritionnel traditionnel) et Stair-Step (alimentation et restriction pendant le développement) qui ont été coupés en environ 0,5-1 mm³ morceaux. Ces morceaux ont ensuite été passés à travers une série de lavages et positionnés sur un insert de culture tissulaire qui est placé dans un puits contenant le milieu de culture de Waymouth. Le cortex ovarien a été cultivé pendant 7 jours avec des changements quotidiens des milieux de culture. Une section histologique a été effectuée pour déterminer les changements de stade folliculaire avant et après la culture afin de déterminer les effets de la nutrition et l’impact de la culture sans traitement supplémentaire. Le milieu de culture du cortex a été mis en commun au fil des jours pour mesurer les stéroïdes, les métabolites stéroïdiens et les cytokines. Il y avait des tendances à l’augmentation des hormones stéroïdes dans le microenvironnement ovarien qui ont permis la progression du follicule dans les cultures Stair-Step versus Control ovarian cortex. La technique de culture du cortex ovarien permet de mieux comprendre le microenvironnement ovarien et comment les altérations de la sécrétion endocrinienne peuvent affecter la progression et la croissance des follicules à partir de traitements in vivo et in vitro. Cette méthode de culture peut également s’avérer bénéfique pour tester des thérapies potentielles susceptibles d’améliorer la progression des follicules chez les femmes afin de favoriser la fertilité.

Introduction

Le cortex ovarien représente la couche externe de l’ovaire où se produit le développement du follicule¹. Les follicules primordiaux, initialement arrêtés en développement, seront activés pour devenir des follicules primaires, secondaires, puis antraux ou tertiaires à partir des apports de paracrine et de gonadotrophine^1,2,3,4. Pour mieux comprendre les processus physiologiques au sein de l’ovaire, la culture tissulaire peut être utilisée comme modèle in vitro, permettant ainsi à un environnement contrôlé de mener des expériences. De nombreuses études ont utilisé la culture de tissu ovarien pour la recherche sur la technologie de procréation assistée, la préservation de la fertilité et le cancer de l’ovaire^5,6,7. La culture de tissu ovarien a également servi de modèle pour étudier les toxines reproductrices qui nuisent à la santé ovarienne et à l’étiologie des troubles de la reproduction tels que le syndrome des ovaires polykystiques (SOPK)^8,9,10,11. Ainsi, ce système de culture est applicable à un large éventail de spécialités.

Chez les rongeurs, des gonades fœtales ou périnatales entières ont été utilisées dans des expériences de biologie de la reproduction^12,13,14,15. Cependant, les gonades provenant d’un gros bétail domestique ne peuvent pas être cultivées en tant qu’organes entiers en raison de leur grande taille et de leur dégénérescence potentielle. Par conséquent, le cortex ovarien des primates bovins et non humains est coupé en plus petits morceaux^16,17,18. De nombreuses études ont cultivé de petits morceaux de cortex ovarien pour étudier divers facteurs de croissance dans l’initiation du follicule primordial chez le bétail domestique et les primates non humains^1,17^,18,19. L’utilisation de la culture du cortex ovarien a également démontré l’initiation du follicule primordial en l’absence de sérum pour les morceaux corticaux bovins et primates cultivés pendant 7 jours^20. Yang et Fortune en 2006 ont traité le milieu de culture du cortex ovarien fœtal avec une gamme de doses de testostérone sur 10 jours et ont observé que la concentration de 10^{à 7} M de testostérone augmentait le recrutement des follicules, la survie et augmentait la progression des follicules à un stade précoce¹⁹. En 2007, en utilisant des cultures de cortex ovarien de fœtus bovins (5-8 mois de gestation), Yang et Fortune ont rapporté un rôle pour le facteur de croissance de l’endothélium vasculaire A (VEGFA) dans la transition du follicule primaire au secondaire^21. En outre, notre laboratoire a utilisé des cultures de cortex ovarien pour démontrer comment les isoformes VEGFA (angiogéniques, antiangiogéniques et une combinaison) peuvent réguler différentes voies de transduction du signal à travers le récepteur du domaine kinase (KDR), qui est le principal récepteur de transduction du signal que VEGFA lie¹⁶. Cette information a permis de mieux comprendre comment différentes isoformes de VEGFA affectent les voies de signalisation pour provoquer la progression ou l’arrêt des follicules. Pris ensemble, la culture de morceaux de cortex ovarien in vitro avec différents stéroïdes ou facteurs de croissance peut être un test précieux pour déterminer les effets sur les mécanismes régulant la folliculogenèse. De même, les animaux qui sont développés sur différents régimes nutritionnels peuvent avoir modifié les microenvironnements ovariens, ce qui peut favoriser ou inhiber la folliculogenèse affectant la maturité reproductive féminine. Ainsi, notre objectif dans le présent manuscrit est de rapporter la technique de culture du cortex bovin et de déterminer s’il existe des différences dans les microenvironnements ovariens après la culture in vitro du cortex bovin à partir de génisses nourries avec des régimes Control ou Stair-Step collectés à l’âge de 13 mois comme décrit précédemment¹⁶.

Par conséquent, notre prochaine étape a été de déterminer le microenvironnement ovarien chez ces génisses qui ont été développées avec différents régimes nutritionnels. Nous avons évalué le cortex ovarien de génisses nourries avec un régime Stair-Step ou Control. Les génisses témoins se sont vu offrir un régime d’entretien de 97,9 g/kg^0,75 pendant 84 jours. Le régime Stair-Step a été initié à 8 mois contenant un régime alimentaire restreint de 67,4 g / kg^0,75 pendant 84 jours. Après les 84 premiers jours, alors que les génisses témoins continuaient de recevoir 97,9 g/kg^0,75, les génisses de bœuf Stair-Step se sont vu offrir 118,9 g/kg^0,75 pendant 68 autres jours, après quoi elles ont été ovariectomisées à l’âge de 13 mois¹⁶ ans pour étudier les changements dans les stades folliculaires et la morphologie avant et après la culture. Nous avons également testé les différences dans les stéroïdes, les métabolites stéroïdiens, les chimiokines et les cytokines sécrétées dans le cortex. Les stéroïdes et autres métabolites ont été mesurés pour déterminer s’il y avait des effets directs des traitements menés in vivo et / ou in vitro sur la viabilité et la productivité des tissus. Les changements dans le microenvironnement ovarien avant et après la culture ont fourni un aperçu du milieu endocrinien et de la folliculogenèse avant la culture et de la façon dont la culture ou le traitement pendant la culture affecte la progression ou l’arrêt du follicule.

Les ovaires ont été prélevés après que des ovariectomies ont été effectuées au U.S. Meat Animal Research Center (USMARC) selon leurs procédures IACUC auprès de génisses Control et Stair-Step à l’âge de^{13 mois 16}ans, nettoyées avec des lavages de solution saline tampon phosphate stérile (PBS) avec 0,1% d’antibiotique pour éliminer le sang et d’autres contaminants, coupé l’excès de tissu et transporté au laboratoire de physiologie de la reproduction DE l’Université du Nebraska-Lincoln (UNL) UNL à 37 ° C²³ . À l’UNL, les morceaux de cortex ovarien ont été coupés en petits morceaux carrés (~0,5-1 mm³; Figure 1) et cultivé pendant 7 jours (Figure 2). L’histologie a été réalisée sur les lames de culture du cortex avant et après la culture afin de déterminer les stades^16et24 des follicules(figure 3 et figure 4)et les protéines de la matrice extracellulaire pouvant indiquer une fibrose (Picro-Sirus Red, PSR; Figure 5). Cela a permis de déterminer l’effet des régimes nutritionnels in vivo sur les stades folliculaires et de comparer 7 jours de cortex ovarien sur les stades folliculaires et la progression des follicules. Tout au long de la culture, le milieu a été recueilli et modifié quotidiennement (environ 70 % des milieux ont été recueillis chaque jour; 250 μL/puits) afin que les hormones/cytokines/chimiokines quotidiennes puissent être évaluées ou regroupées sur des jours pour obtenir des concentrations moyennes. Les stéroïdes tels que l’androstènedione (A4) et l’œstrogène (E2) peuvent être regroupés sur 3 jours et évalués par dosage radioimmunologique (RIA; Graphique 6) et regroupés sur 4 jours par animal et analysés par chromatographie liquide à haute performance-spectrométrie de masse (HPLC-MS)^24,25 ( tableau1). Des réseaux de cytokines ont été utilisés pour évaluer les concentrations de cytokines et de chimiokines dans le milieu de culture du cortex ovarien²⁶ (tableau 2). Des plaques de dosage de la réaction en chaîne par polymérase en temps réel (RT-PCR) ont été menées pour déterminer l’expression des gènes pour des voies de transduction de signal spécifiques, comme démontré précédemment¹⁶. Tous les marqueurs stéroïdes, cytokines, follicules et histologiques fournissent un instantané du microenvironnement ovarien et des indices quant à la capacité de ce microenvironnement à favoriser la folliculogenèse « normale » ou « anormale ».

Protocol

Les ovaires ont été obtenus du U. S. Meat Animal Research Center16. Comme indiqué précédemment16, toutes les procédures ont été approuvées par le comité de soins et d’utilisation des animaux du U.S. Meat Animal Research Center (USMARC) conformément au guide pour les soins et l’utilisation des animaux d’élevage dans la recherche et l’enseignement agricoles. Les ovaires ont été amenés au laboratoire de reproduction de l’Université du Nebraska-Lincoln…

Representative Results

Cette procédure de culture du cortex bovin peut être utilisée pour déterminer une grande variété de données hormonales, cytokines et histologiques à partir de petits morceaux de l’ovaire. La coloration, telle que l’hématoxyline et l’éosine (H & E), peut être utilisée pour déterminer la morphologie ovarienne par la stadification des follicules16,23,31 ( Figure3). En bref, les folli…

Discussion

L’avantage de la culture in vitro du cortex ovarien, tel que décrit dans ce manuscrit, est que les follicules se développent dans un environnement normalisé avec un stroma adjacent entourant les follicules. Les cellules somatiques et les ovocytes restent intacts, et il existe une communication appropriée de cellule à cellule en tant que modèle in vivo. Notre laboratoire a découvert qu’un système de culture de 7 jours fournit des données représentatives de la folliculogenèse et de la stéroïdogenèse pour …

Materials

#11 Scapel Blade	Swann-Morton	303	Scaple Blade
#21 Scapel Blade	Swann-Morton	307	Scaple Blade
500mL Bottle Top Filter	Corning	430514	Bottle Top Filter 0.22 µm pore for filtering medium
AbsoluteIDQ Sterol17 Assay	Biocrates	Sterol17 Kit	Samples are sent off to Biocrates and steroid panels are run and results are returned
Androstenedione Double Antibody RIA Kit	MPBio	7109202	RIA to determine androstenedione from culture medium
Belgium A4 Assay Kit	DIA Source	KIP0451	RIA to determine androstenedione from culture medium
Bovine Cytokine Array Q3	RayBiotech	QAB-CYT-3-1	Cytokine kit to determine cytokines from culture medium
cellSens Software Standard 1.3	Olympus	7790	Imaging Software
Insulin-Transferrin-Selenium-X	Gibco ThermoFisher Scientific	5150056	Addative to the culture medium
Leibovitz's L-15 Medium	Gibco ThermoFisher Scientific	4130039	Used for tissue washing on clean bench, and in the biosafety cabniet
Microscope	Olympus	SZX16	Disection microscope used for imaging tissue culture pieces
Microscope Camera	Olympus	DP71	Microscope cameraused for imaging tissue culture pieces
Millicell Cell Culture Inserts 0.4µm, 12,mm Diameter	Millipore Sigma	PICM01250	Inserts that allow the tissue to rest against the medium without being submerged in it
Multiwell 24 well plate	Falcon	353047	Plate used to hold meduim, inserts, and tissues
Petri dish 60 x 15 mm	Falcon	351007	Petri dish used for washing steps prior to culture
Phosphate-Buffered Saline (PBS 1X)	Corning	21-040-CV	Used for tissue washing
SAS Version 9.3	SAS Institute	9.3 TS1M2	Statistical analysis software
Thomas Stadie-Riggs Tissue Slicer	Thomas Scientific	6727C10	Tissue slicer for preperation of thin uniform sections of fresh tissue
Waymouth MB 752/1 Medium	Sigma-Aldrich	W1625	Medium used for tissue cultures