Evaluación de las propiedades angiogenéticas de las células madre similares al cáncer de ovario utilizando el sistema de cocultivo tridimensional, NICO-1
Summary
Las células madre del cáncer de ovario (OCSC) son responsables de la iniciación, recurrencia, resistencia terapéutica y metástasis del cáncer. Se considera que el nicho vascular OCSC promueve la autorrenovación de las OCSC, lo que lleva a la quimiorresistencia. Este protocolo proporciona la base para establecer un modelo de nicho vascular OCSC reproducible in vitro.
Abstract
Las células madre cancerosas (CSC) residen en un nicho de apoyo, constituyendo un microambiente compuesto por células estromales adyacentes, vasos y matriz extracelular. La capacidad de las CSC para participar en el desarrollo del endotelio constituye una característica importante que contribuye directamente a la comprensión general de los mecanismos de tumorigénesis y metástasis tumorales. El propósito de este trabajo es establecer una metodología reproducible para investigar la capacidad de iniciación tumoral de las células madre del cáncer de ovario (OCSC). En este documento, examinamos el mecanismo de neovascularización entre las células endoteliales y las OCSC junto con los cambios morfológicos de las células endoteliales utilizando el modelo de cocultivo in vitro NICO-1. Este protocolo permite visualizar el paso de neovascularización que rodea a los OCSC en un curso de tiempo. La técnica puede proporcionar información sobre las propiedades angiogenéticas de las OCSC en la metástasis tumoral.
Introduction
El cáncer de ovario es la octava neoplasia maligna más común en mujeres en todo el mundo, con aproximadamente 300.000 nuevos diagnósticos y un estimado de 180.000 muertes anuales1. En el momento del diagnóstico inicial, el cáncer de ovario a menudo se presenta con síntomas graves, con aproximadamente el 75% de las pacientes ya en estadio III-IV. En consecuencia, la tasa de supervivencia a 5 años es del <30% y la tasa de mortalidad es la más alta entre los cánceres ginecológicos2, siendo la eficiencia del tratamiento para el cáncer de ovario altamente dependiente de factores clínicos como la realización exitosa de la cirugía citorreductora, la resistencia a la quimioterapia y la recurrencia después de la terapia inicial.
Los tejidos del cáncer de ovario están organizados jerárquicamente, y no todos los componentes tumorales son igualmente capaces de generar descendientes. Se considera que las únicas células capaces de autorrenovarse y producir una población heterogénea de células tumorales representan células madre cancerosas (CSCs)3. La autorrenovación de CSC y el inicio del tumor se acompañan de la promoción de la angiogénesis para remodelar su microambiente tumoral con el fin de mantener un nicho de apoyo. Sin embargo, los modelos anteriores no pudieron utilizarse para análisis in vitro debido a la limitada reproducibilidad del cultivo de CSC derivadas de muestras clínicas debido a la interrupción de los esferoides después de múltiples pasantías. Más recientemente, se han desarrollado métodos experimentales para cultivar CSCs de pacientes para varias aplicaciones 4,5,6,7. En particular, al explotar la característica de las CSC para crecer formando esferoides en placas de unión ultra bajas con medio libre de suero, las CSC cultivadas son inducidas a expresar un marcador de superficie de células madre que no se expresa en células tumorales normales con potencial de diferenciación multilinaje 8,9.
Datos recientes han demostrado que la persistencia de (O)CSCs ováricas latentes visualizadas como diseminación en el peritoneo está asociada a su regeneración como tumores recurrentes10. Por lo tanto, comprender las características moleculares y biológicas de las OCSC puede permitir una orientación y erradicación efectivas de estas células, lo que resulta en una posible remisión tumoral. En particular, se sabe poco sobre las características mecanicistas celulares y moleculares de los roles de las CSC en la angiogénesis11. Por lo tanto, en el presente protocolo utilizamos OCSC derivadas de pacientes en un entorno in vitro para investigar la propiedad angiogénica de las células endoteliales utilizando el modelo de cocultivo, que puede imitar el microambiente tumoral de las CSC y las células endoteliales en el sitio metastásico en el entorno clínico. En última instancia, como la neovascularización constituye un proceso crítico necesario para apoyar el crecimiento tumoral y la metástasis, una mejor comprensión de su mecanismo permitirá el desarrollo de una nueva terapia dirigida para OCSC en el sitio metastásico.
Aquí, presentamos un protocolo para visualizar el paso de neovascularización que rodea a las CSC de una manera de curso temporal. La ventaja del protocolo incluye permitir investigaciones totalmente reproducibles utilizando el sistema de cocultivo 3D, NICO-1, lo que permite la observación de los efectos en pacientes de la capacidad de iniciación tumoral derivada de OCSC durante la angiogénesis de células endoteliales.
Protocol
Representative Results
Discussion
El protocolo presentado describe cómo imitar el microambiente tumoral de las OCSC en un entorno in vitro. El componente principal del método constituye el modelo de cocultivo altamente reproducible obtenido utilizando el sistema NICO-1, un sistema de cocultivo Transwell indirecto. Muchos de los modelos de cocultivo actualmente disponibles examinan los efectos del contacto directo célula-célula en poblaciones celulares cocultivadas 12,13,14,15,16,17,18.</…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por una subvención para la investigación científica C (subvención no. 19K09834 a K.N.) del Ministerio de Educación, Ciencia y Cultura de Japón.
Materials
| 0.025% Trypsin | Thermo | R001100 | |
| 10 mL Pipet | Thermo | 170356N | |
| 1250 µL Pipet tip | QSP | T112XLRS-Q | |
| 15 mL tube | Nunc | 339650 | |
| 200 µL Pipet tip | QSP | T110RS-NEW | |
| 2-Mercaptoethanol | Thermo (Gibco) | 21985023 | |
| 5 mL Pipet | Thermo | 170366N | |
| 50 mL tube | Corning | 430290 | |
| AccuMAX | Innovative Cell Technologies | AM105 | |
| BioCoatTM Collagen I 60mm Dish | Corning | 356401 | |
| Centrifuge | KUBOTA | 2800 | |
| Costar 6 Well Clear Flat Bottom Ultra Low Attachment Multiple Well Plates | Corning | 3471 | |
| Endothelial Cell Growth Medium 2 | PromoCell | C-22011 | |
| Ethanol | WAKO | 057-00456 | |
| FGF-Basic | Thermo (Gibco) | PHG0021 | |
| Histodenz | SIGMA | D2158 | |
| HUEhT-1 cell | JCRB Cell Bank | JCRB1458 | |
| ICCP Filter 0.6 µm | Ginrei Lab. | 2525-06 | |
| Insulin, human | SIGMA (Roche) | 11376497001 | |
| Luminometer | PerkinElmer | ARVO MX-flad | |
| Matrigel Matrix | Corning | 356234 | |
| Microscope | Yokogawa | CQ-1 | |
| NICO-1 | Ginrei Lab. | 2501-02 | |
| OptiPlate-96 | PerkinElmer | 6005290 | |
| P1000 Pipet | Gilson | F123602 | |
| P200 Pipet | Gilson | F123601 | |
| PBS | Thermo (Gibco) | 14190-144 | |
| StemPro hESC SFM | Thermo (Gibco) | A1000701 | |
| Transfer Pipet | FALCON | 357575 | |
| Y-27632 | WAKO | 253-00513 |
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