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膜蛋白共翻译插入预制纳米盘

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DOI：

10.3791/61844

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2020年11月19日

 ,  ,  , 
1Institute of Biophysical Chemistry, Goethe University Frankfurt

本文内容

摘要

共翻译插入预形成的纳米盘中，可实现无变性剂接触条件下，在明确的脂质环境中研究无细胞合成的膜蛋白。本方案描述了关键系统组分的制备方法，以及提高表达效率和样品质量的关键参数。

摘要

无细胞表达系统允许对反应环境进行定制化设计，以支持复杂蛋白质（如膜蛋白）的功能性折叠。本文展示了将膜蛋白共翻译插入并折叠到作为纳米盘提供的预形成且组分明确的膜中的实验操作流程。该方案完全无需去污剂，可在一天内生成毫克级纯化样品。所得膜蛋白/纳米盘样品可用于多种功能研究及结构分析应用，如结晶、核磁共振或电子显微镜。文中详细描述了基本关键组分的制备，包括无细胞裂解液、具有设计膜结构的纳米盘、关键储备溶液，以及双室无细胞表达反应体系的组装。由于膜蛋白的折叠需求差异较大，本方案的重点在于调控对样品质量至关重要的参数和反应步骤，例如关键的基础反应组分、纳米盘的膜组成、氧化还原环境与分子伴侣环境，以及DNA模板设计。整个过程以紫红质蛋白（proteorhodopsin）和一种G蛋白偶联受体的合成为例进行演示。

引言

膜蛋白（MPs）由于在水相环境中不溶，因此在蛋白质生产研究中是具有挑战性的目标。传统的膜蛋白生产平台包括基于细胞的系统，如大肠杆菌（E. coli）、酵母或真核细胞。所合成的重组膜蛋白可从细胞膜中提取，或从包涵体中复性获得1。经过去垢剂增溶后，可通过已建立的体外重建方法将膜蛋白转移至合适的膜环境中。除囊泡和脂质体外，近年来将膜蛋白重建为纳米盘2或salipro3颗粒等形式的平面膜结构也已成为常规技术。然而，所有这些策略均涉及膜蛋白与去垢剂的接触，可能导致蛋白不稳定、寡聚体解离，甚至蛋白结构和活性的丧失4。因此，筛选最佳的去垢剂增溶和重建条件可能十分繁琐且耗时5。

无细胞（CF）系统的开放性使得表达反应能够直接获得具有特定脂质组成的预制膜。在这种基于脂质的表达模式（L-CF）中，合成的膜蛋白可在翻译过程中共翻译地插入所提供的双分子层中6,7 (图1由膜支架蛋白（MSP）环绕平面脂双层盘形成的纳米盘8 似乎特别适用于该策略9,10纳米盘通常可在体外使用多种不同的脂质组装而成，具有高度稳定性，且储存浓度可高达1 mM。然而，MSP的表达在 E. coli 及其纯化是必要的。作为替代策略，可以在添加了脂质体的无细胞反应中共同表达MSP与目标膜蛋白（MP）11,12,13MSP和MP的DNA模板均加入反应体系，MP/纳米盘可在表达后形成。尽管避免了MSP的生产，但共表达策略需要对最终DNA模板浓度进行精细优化，且样品制备效率可能出现较大波动。

膜蛋白共翻译插入预制纳米盘膜是一种非生理性的机制，该机制独立于转运子机器和信号序列，目前仍知之甚少13,14,15,16。影响插入效率的主要因素包括膜蛋白的类型以及所提供膜的脂质组成，其中常表现出对带负电荷脂质的偏好15,17。由于纳米盘膜的尺寸相对受限，膜蛋白插入时会释放出大量脂质18。通过调节纳米盘的大小，可实现更高阶寡聚膜蛋白复合物的插入与调控15,18。已有研究表明，多种同源寡聚复合物能够正确组装，例如离子通道KcsA、离子泵蛋白视紫红质（PR）以及多药转运蛋白EmrE15,18。膜蛋白很可能以相近的频率从对称的纳米盘膜两侧进入。因此应考虑到，插入同一纳米盘中的不同单体或寡聚体可能具有相反的取向。然而，协同插入机制可能导致取向偏倚，例如在PR六聚体和KcsA四聚体形成过程中已有报道18。此外，已插入的膜蛋白可能在纳米盘膜边缘发生取向转换，从而进一步导致膜蛋白取向的偏倚。

从CF中制备裂解液 E. coli 菌株鉴定是一种可靠的常规技术，几乎可在任何生物化学实验室中进行19,20需要考虑到，如果膜蛋白（MP）通过该方法合成，则除二硫键形成外，大多数其他翻译后修饰均不存在。 E. coli 裂解物。虽然这可能为结构研究产生更均一的样品，但可能需要排除对单个膜蛋白靶标功能的潜在影响。然而，高效制备高质量的G蛋白偶联受体（GPCR）样品14,21,22真核生物转运蛋白23 或大型异源多聚体复合物24 在 E. coli CF裂解物表明其适用于甚至复杂的靶标。采用由反应混合物（RM）和喂养混合物（FM）室组成的双室连续交换无细胞（CECF）系统，可获得制备规模的样品量（≈ 1 mg/mL）。FM体积超过RM体积15至20倍，可为小分子量能量化合物和前体提供储备。19因此，表达反应可延长数小时，从而提高MP目标产物的最终得率。RM与FM两个区室由截留分子量为10–14 kDa的透析膜隔开。这两个区室需要对CECF反应容器进行特殊设计。图1）。商用透析盒作为反应混合物（RM）容器，结合定制的有机玻璃容器承载流动相（FM），是合适的示例。通过调整RM与FM的比例，或在一定孵育时间后更换FM，可进一步调控微粒（MP）的产量。

膜蛋白的产量和质量通常需要对反应参数进行深入优化。无细胞表达的一个重要优势在于，几乎可以针对膜蛋白的个体需求，对任何组分进行修改和精细调节。一个直接的策略是，首先通过建立基本的生产方案来提高膜蛋白的产量，随后通过精细调整反应条件和折叠环境来优化膜蛋白的质量。由于无细胞裂解液中缺乏生理过程且体系复杂性较低，因而在高效生产膜蛋白方面具有很高的成功率25。在大多数情况下，仅需常规考虑DNA模板设计以及优化Mg2+离子浓度，即可获得令人满意的产量26。根据表达模式的不同，膜蛋白质量的优化可能较为耗时，因为需要筛选的参数种类更多14,17,22。

为建立所述的CF表达平台，需要制定用于生产的相关方案 E. coli CF裂解液（i）、T7 RNA聚合酶（ii）、纳米盘（iii）和基础CECF反应组分（iv）图1）。该 E. coli K12 菌株 A1927 或 BL21 衍生菌株常用于高效 S30 提取物的制备（30,000 × g 离心） g) 裂解液。除了S30裂解液外，还包括在其他转速下离心的相应裂解液 g-力（例如 S12）可被使用。这些裂解液在表达效率和蛋白质组复杂性方面有所不同。通过所述方案制备的 S30 裂解液的蛋白质组已被深入研究28S30 蛋白质组仍含有少量残留的外膜蛋白，在表达和分析离子通道时可能引起背景干扰问题。对于此类靶标，建议使用 S80-S100 裂解物。在裂解物制备过程中，一种有效的改进方法是在细胞对数生长中期联合施加热激和乙醇以诱导 SOS 反应。由此获得的 HS30 裂解物富含分子伴侣，可与 S30 裂解物混合使用，以改善膜蛋白的折叠效率22CF 在中的表达 E. coli 裂解液中的反应以偶联的转录/翻译过程进行，所用DNA模板含有由T7 RNA聚合酶（T7RNAP）调控的启动子。该酶可在携带pAR1219质粒的BL21(DE3) Star细胞中高效表达。29.

两个MSP1E3D1分子可组装成一个直径为10–12 nm的纳米盘，但以下所述方案也可能适用于其他MSP衍生物。然而，使用MSP1E3D1形成的纳米盘若尺寸更大，则往往稳定性较差；而使用MSP1等MSP衍生物形成的较小纳米盘可能无法容纳较大的膜蛋白（MP）或膜蛋白复合物。MSP1E3D1纳米盘可在体外与多种不同的脂质或脂质混合物组装。预先形成的纳米盘在-80 °C下通常可稳定保存超过>1年，但不同脂质组分的稳定性可能有所差异。为了筛选脂质对膜蛋白折叠和稳定性的影响，有必要制备一组包含代表性脂质/脂质混合物的纳米盘。以下脂质可作为良好的起始选择：1,2-二肉豆蔻酰-sn-甘油-3-磷酸-(1'-外消旋-甘油)（DMPG）、1,2-二肉豆蔻酰-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱（DMPC）、1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷脂酰-外消旋-(1-甘油)（DOPG）、1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱（DOPC）、1-棕榈酰-2-油酰-sn-甘油-3-磷酸-(1'-外消旋-甘油)（POPG）以及1-棕榈酰-2-油酰-甘油-3-磷脂酰胆碱（POPC）。

描述了制备3 mL CECF反应体系的方案。该体系可按1:1比例进行同比例放大或缩小。对于双室CECF构型，需准备含有所有组分的反应室溶液（RM）和仅含小分子化合物的透析液（FM）。可使用市售的3 mL透析装置（截留分子量为10–14 kDa）作为RM的容器，然后将其置于自制的有机玻璃容器中，该容器用于盛装FM。图1D)30RM与FM的比例为1:20，因此每3 mL RM需配制60 mL FM。多种组分的质量、浓度或类型可能对合成MP的最终产率和/或质量具有关键影响。表1）。DNA模板应根据已发表的指南进行制备，对目标基因的阅读框进行密码子优化可进一步显著提高产物产量26对于制备规模的CECF反应，已有针对PR蛋白生产的成熟方案。为建立新膜蛋白（MPs）的表达方案，通常需要对某些化合物进行优化筛选。表1）以提高产量和质量。对于 Mg2+ 离子，确实存在一个明确的浓度最适点，但该最适点常因不同的DNA模板而表现出显著差异。其他CF反应组分，例如新批次的T7 RNA聚合酶或S30裂解液，也可能进一步改变最适Mg²⁺浓度。2+ 浓度。例如，一种典型的 Mg2+ 在14-24 mM浓度范围内，以2 mM为梯度进行筛选。每个浓度均以双份重复进行，并在分析级CECF反应中开展。CECF反应容器采用定制的Mini-CECF有机玻璃容器。30 使用带有RM的夹具与装有FM的标准24孔微孔板配合使用（图1B）。或者，可使用商用透析盒结合96深孔微孔板，或在适当装置中使用其他商用透析设备（图1C).

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方案

1. S30 裂解液的制备

  1. 第1天： 从甘油菌种中挑取菌液，在LB琼脂平板上划线，37 °C过夜培养。
  2. 第2天： 从琼脂平板上挑取菌落接种于200 mL LB培养基中，37 °C培养12–14小时。
  3. 第3天： 接种10 L无菌YPTG培养基（10 g/L酵母提取物，16 g/L胰蛋白胨，5 g/L NaCl，19.8 g/L葡萄糖，4.4 mM KH2PO4，8 mM K2HPO4) 在15 L搅拌罐反应器中，加入100 mL预培养液（1:100），于37 °C条件下培养。在37 °C、500 rpm及高通气量（约3体积空气/分钟）下培养。为防止过度起泡，加入无菌消泡剂。
  4. 在常规时间间隔下于600 nm处测定光密度（OD）。培养约2小时后，菌液将进入对数生长期。
  5. HS30 裂解液的修饰方法： 当细胞处于对数中期（OD600 ≈ 3.6–4.2）时，向培养基中加入300 mL乙醇，并在42 °C、500 rpm及高通气量（约每分钟3个体积空气）条件下继续培养45分钟。随后按照步骤1.6所述进行细胞培养物的冷却和收集。如需制备标准S30裂解液，则跳过此步骤，直接进行步骤1.6。
  6. 当细胞处于对数中期（OD600 ≈ 3.6–4.2）时， 冷却 20 °C 以下的发酵罐内 < 30 分钟。最终 OD600 应在 4.5–5.5 左右。 收获 4,500 × 离心细胞 g 4 °C下离心20分钟，弃去上清液。后续步骤中始终将细胞置于4 °C环境中。
    注意：冷却过程中可能会产生过度起泡。此时，可添加消泡剂，或降低搅拌速度和/或减少生物反应器中的通气量。
  7. 将细胞完全悬浮于 300 mL S30-A 缓冲液（10 mM Tris-HCl，pH 8.2，14 mM Mg(OAc)2，60 mM KCl，6 mM 2-巯基乙醇）中，用刮勺混匀，再通过移液吹打使悬浮液均匀。在8,000 x g 4 °C下离心10分钟。重复此步骤两次。
    警告：2-巯基乙醇具有毒性，避免接触皮肤或呼吸道。如有可能，应在通风橱内操作。在最后一次洗涤步骤前，称量空的离心杯质量。离心后，称量湿细胞沉淀的质量，随后可直接进行步骤1.8，或将沉淀保存以备后续使用。
    注意：每升生物反应器培养物所得湿细胞沉淀的重量为5-7 g。此时可暂停实验流程，将沉淀用液氮速冻后于-80 °C保存4-8周。
  8. 将细胞充分重悬于1.1倍体积（1 g = 1 mL）的S30-B缓冲液（10 mM Tris-HCl，pH 8.2，14 mM Mg(OAc)₂，60 mM 醋酸钾）中2，60 mM KOAc，1 mM DTT，1片cOmplete蛋白酶抑制剂）。将悬浮液加入预冷的法式高压破碎仪压力腔中，在1,000 psig条件下破碎细胞一次。
  9. 将裂解液在 30,000 x g 4 °C下孵育30分钟。将上清液转移至新管中，并重复离心步骤。
    注意：第一次离心后，沉淀物表面可能存在一层松散且黏滑的物质，转移上清液时不应将此层一同转移。
  10. 采用高盐和加热步骤去除不稳定的裂解液组分，并释放核糖体上的mRNA。将裂解液调至0.4 M NaCl，于42 °C水浴中孵育45分钟。
    注意：此步骤将产生大量沉淀。孵育期间需不时翻转或倒置离心管。
  11. 将浑浊的悬浮液（通常为 50–80 mL）转移至截留分子量为 10–14 kDa 的透析管中，用 5 L S30-C 缓冲液（10 mM Tris-HCl，pH 8.2，14 mM Mg(OAc)2，60 mM KOAc，0.5 mM DTT）。透析2–3小时后更换S30-C透析缓冲液，再继续透析12–14小时。
  12. 第4天： 将透析后的悬液转移至离心管中，在30,000 x g 4 °C 下孵育 30 分钟。将上清液（S30 裂解物）转移至新的 50 mL 离心管中，轻轻混匀。裂解物的蛋白浓度应约为 30–40 mg/mL。取适量分装（如 0.5 mL、1 mL），在液氮中速冻后于 -80 °C 保存。分装样品在此条件下稳定 > 1年。

2. T7 RNA 聚合酶的表达与纯化

  1. 第1天：在含有100 µg/mL氨苄青霉素的200 mL LB培养基中接种新鲜平板培养的BL21(DE3) Star x pAR1219细胞，于37 °C、180 rpm条件下培养12–16小时。
  2. 第2天：在2 L带挡板的三角瓶中加入1 L优质肉汤（每升含12 g胰蛋白胨、24 g酵母提取物、4 mL甘油），并加入10 mL预培养物，于37 °C、180 rpm振荡培养。起始OD600应约为0.1。
  3. 当OD600达到0.6–0.9时，加入IPTG至终浓度1 mM以诱导T7RNAP表达，并继续培养5小时。
  4. 在4 °C条件下以4,500 × g离心20分钟收集细胞。用液氮速冻细胞后于-80 °C保存。
    注意：本步骤可在此处暂停。
  5. 第3天：向冷冻的细胞沉淀中加入30 mL预冷的悬浮缓冲液（30 mM Tris-HCl，pH 8.0，含一片cOmplete蛋白酶抑制剂），在室温水浴中解冻沉淀，然后通过反复吹打使其充分悬浮至均匀状态。
  6. 按照前述方法使用高压破碎仪进行细胞破碎，或根据制造商说明使用超声破碎仪。随后在4 °C条件下以20,000 × g离心30分钟，将上清液转移至新离心管中。
  7. 为沉淀基因组DNA，边轻轻搅拌边缓慢加入硫酸链霉素，直至终浓度达到3%（w/v）。在4 °C、轻柔搅拌条件下孵育5–10分钟，然后在4 °C条件下以20,000 × g离心30分钟。
  8. 使用0.45 µm滤膜过滤上清液，并通过蠕动泵以4 mL/min流速将其上样至已用2 CV平衡缓冲液（30 mM Tris-HCl，pH 8.0，10 mM EDTA，50 mM NaCl，5%甘油，10 mM 2-巯基乙醇）预平衡的Q-Sepharose柱（柱体积为40 mL）。随后连接紫外检测器，继续用平衡缓冲液洗脱，直至280 nm处的紫外信号达到稳定基线。
  9. 采用每柱体积NaCl浓度从50 mM线性梯度洗脱至500 mM的方式洗脱T7RNAP，流速为3 mL/min。收集1 mL组分，并通过将每组分10 µL与2× SDS上样缓冲液混合制备SDS-PAGE样品。进行SDS-PAGE电泳后用考马斯亮蓝R染色。T7RNAP应表现为约90 kDa处一条明显条带，同时伴有多种杂质蛋白条带。
  10. 合并含T7RNAP的组分，使用截留分子量为12–14 kDa的透析袋在透析缓冲液（10 mM K2HPO4/KH2PO4，pH 8.0，10 mM NaCl，0.5 mM EDTA，1 mM DTT，5%（w/v）甘油）中透析12–16小时。
  11. 第4天：收集透析后的T7RNAP溶液，使用截留分子量为12–14 kDa的超滤装置浓缩至终浓度3–10 mg/mL。浓缩过程中T7RNAP可能开始析出，一旦样品出现浑浊应立即停止浓缩。加入甘油至终浓度50%（w/v），轻柔混匀。将0.5–1 mL分装样品速冻后于-80 °C保存。工作用T7RNAP分装样品可于-20 °C保存。
    注意：从1 L发酵液中通常可获得约20–40 mL浓度为5 mg/mL的部分纯化T7RNAP，酶活性约为20,000–40,000单位。为确定每批T7RNAP的最佳使用量，应进行绿色荧光蛋白（GFP）的无细胞表达反应，反应中加入0.02 mg/mL–0.1 mg/mL的T7RNAP样品进行测试。

3. MSP1E3D1 的表达与纯化

  1. 第1天： 转化 E. coli BL21 (DE3) Star 感受态细胞携带 pET28(a)-MSP1E3D1 质粒31 使用标准的热激转化或电穿孔方法。将转化后的细胞涂布于含有30 µg/mL卡那霉素的LB琼脂平板上，37 °C培养12–16小时。
  2. 第2天： 从琼脂平板上挑取单菌落，接种于200 mL LB培养基中，培养基中添加0.5%（w/v）葡萄糖和30 µg/mL卡那霉素，于37 °C、180 rpm条件下振荡培养12–16 h。
  3. 第3天： 在搅拌罐式生物反应器中，将100 mL预培养物接种至10 L LB培养基中，培养基中添加0.5%（w/v）葡萄糖和30 µg/mL卡那霉素。在37 °C、500 rpm转速及通气量约为每分钟3个生物反应器体积的条件下进行发酵。若出现过度起泡，可加入消泡剂。
    注意：可使用带挡板的摇瓶代替发酵罐。
  4. 在 OD600 为 6.5–7.5 时，加入 IPTG 至终浓度 1 mM，于 37 °C 继续培养 1 小时。于 4,500 x g 4 °C下孵育20分钟。用200 mL 0.9% (w/v) NaCl洗涤细胞沉淀，然后在8,000 x g条件下再次离心 g 4 °C下离心10分钟。弃去上清液，用刮勺将细胞转移至50 mL离心管中。每升生物反应器培养液预期获得湿细胞沉淀8-12 g。用液氮速冻细胞沉淀，并于-80 °C保存备用。
    注意：此处可暂停本实验方案。
  5. 第4天： 用于纯化时，将细胞沉淀在室温水浴中解冻。用MSP-A缓冲液（40 mM Tris-HCl，pH 8.0，300 mM NaCl，1% (w/v) Triton X-100，每50 mL细胞悬液加入1片c0mplete蛋白酶抑制剂混合片）重悬细胞，制成30–40% (w/v) 的细胞悬液。
  6. 通过超声处理或使用法国压榨器破碎细胞，然后在30,000 × g条件下离心 g 在 4 °C 下孵育 30 分钟。将上清液转移至新离心管中，经 0.45 µm 滤膜过滤。将滤液上样至 Ni2+ 已加载的次氮基三乙酸柱（CV > 15 mL）用蠕动泵以5个柱体积的MSP-B缓冲液（40 mM Tris-HCl，pH 8.0，300 mM NaCl，1% (w/v) Triton X-100）进行平衡。
    注意：为了促进过滤，可将上清液再超声处理1分钟，以降解较大的DNA片段。
  7. 上样后，依次用5个柱体积的MSP-B、5个柱体积的MSP-C（40 mM Tris-HCl，pH 8.9，300 mM NaCl，50 mM 胆酸）、5个柱体积的MSP-D（40 mM Tris-HCl，pH 8.9，300 mM NaCl）、5个柱体积的MSP-E（40 mM Tris-HCl，pH 8.0，300 mM NaCl）和5个柱体积的MSP-F（40 mM Tris-HCl，pH 8.0，300 mM NaCl，50 mM 咪唑）洗涤层析柱。
    注意：MSP-C 缓冲液中的胆酸对于去除与 MSP 结合的脂质至关重要。胆酸在低 pH 值下溶解度较低。因此，MSP-C 和 MSP-D 的 pH 值必须调整至 8.9。使用 MSP-D 缓冲液充分洗涤层析柱十分关键，因为较低的 pH 值可能导致残留的胆酸沉淀，从而堵塞或损坏层析柱。
  8. 用MSP-G（40 mM Tris-HCl，pH 8.0，300 mM NaCl，300 mM 咪唑）洗脱MSP。收集1 mL流份，监测280 nm处的紫外吸收。收集并合并洗脱峰的流份。
  9. 将合并的MSP组分转移至12-14 kDa截留分子量透析膜管中，于4 °C下用5 L MSP-H缓冲液（40 mM Tris-HCl，pH 8.0，300 mM NaCl，10% (w/v) 甘油）透析2-3小时。更换为新鲜的5 L MSP-H缓冲液，继续在4 °C下透析12-16小时。
  10. 第5天： 将MSP溶液转移至离心管中，在18,000 x g条件下离心 g 在 4 °C 下孵育 30 分钟以去除沉淀。将上清液转移至新离心管中，使用截留分子量为 12–14 kDa 的超滤装置在 4 °C 下浓缩至 200–800 µM。使用紫外/可见光检测仪测定浓度，采用消光系数 27.31 M⁻¹cm⁻¹。-1 cm-1 以及用于浓度计算的 31.96 kDa 分子质量。
    注：在生物反应器中表达时，每升培养液通常可获得 15–30 mg 的 MSP1E3D1。
  11. 将浓缩的MSP溶液在液氮中快速冷冻，并于-80 °C保存。

4. MSP1E3D1 纳米盘的组装

  1. 第1天：制备1-2 mL浓度为50 mM的脂质储备液（DMPG、DOPG、POPG、DMPC、DOPC或POPC），溶于100 mM胆酸钠溶液中。若当天不使用，需在-20 °C保存。
    注意：脂质溶液必须澄清。若溶液不澄清，可将胆酸钠浓度提高至150 mM。
  2. 将MSP1E3D1溶液与脂质溶液混合，并加入十二烷基磷酸胆碱（DPC），使其终浓度为0.1%（w/v）。组装反应体系的终体积可调整为3 mL（表2）或12 mL，以匹配典型透析盒（10 kDa截留分子量）的体积。在21 °C下轻轻振荡孵育1小时。
    注意：每种脂质需使用特定的MSP1E3D1:脂质比例，以确保获得均一的纳米盘（表2）。对于新脂质或脂质混合物，应通过预实验结合尺寸排阻色谱分析确定最佳比例14。
  3. 用纳米盘形成缓冲液（DF缓冲液，含10 mM Tris-HCl，pH 8.0，100 mM NaCl）预先润湿透析盒的膜。用注射器将组装混合物转移至透析盒中。如有气泡，可用注射器抽吸去除。
  4. 第1–4天：在室温下，使用磁力搅拌，将透析盒置于DF缓冲液中透析3次，每次5 L，每次持续10–20小时。随后，将组装混合物从透析盒中转移至已用DF缓冲液平衡的10 kDa截留分子量的离心过滤装置中，在4 °C、4,000 × g条件下浓缩。
    注意：透析液浑浊可能表明MSP:脂质化学计量比不正确。在样品浓缩前，需在4 °C下以18,000 × g离心20分钟去除沉淀。为避免样品浓缩过程中发生沉淀，建议使用具有较大死体积的超滤装置。
  5. 将组装完成的纳米盘浓缩至浓度至少为300 µM。使用紫外/可见光分光光度计测定浓度。需注意，每个纳米盘由两个MSP1E3D1分子组成，因此在计算纳米盘的正确浓度时，应将MSP的浓度除以2。
    注意：按照所述实验条件（表2），可获得0.6–1 mL浓度为300 µM的纳米盘溶液。
  6. 将浓缩后的纳米盘样品在4 °C下以18,000 × g离心20分钟，以去除沉淀。然后吸取上清液，取50 µL分装，于液氮中快速冷冻，并在-80 °C保存。
    注意：建议通过尺寸排阻色谱评估纳米盘形成的效率。样品应呈单分散状态，且聚集体含量较低。若存在聚集体，表明体系中脂质含量过高。可使用纯化的MSP1E3D1作为参照。若纳米盘样品在色谱图中出现与参照MSP1E3D1峰高度一致的峰，则表明所选脂质与MSP1E3D1的比例过低。

5. 制备规模3 mL CECF反应体系的建立

  1. 第1天： 准备所有必需的储备溶液（见表3）。储备液储存于-20 °C，使用前室温融化。确保融化后充分混匀所有储备液，再进行移液操作。计算各储备液所需体积，并制定移液方案（表4）。高分子量化合物仅加入到反应混合物（RM）中。对于低分子量化合物，可配制一份3倍浓度的总混合液（mastermix），用于RM和FM的共同添加。
    注意：由于混合过程中可能存在体积损失，最终化合物混合液的实际体积可能小于理论计算值。可通过额外增加2–5%的体积来补偿体积损失，以避免此问题。
  2. 用100 mM Tris-乙酸盐缓冲液（pH 8.0）平衡3 mL透析盒的透析膜。确保去除多余的缓冲液。
  3. 使用注射器将RM转移至透析盒中。用注射器抽吸RM腔室中的多余空气。将透析盒放入透析槽中。
  4. 向透析槽中加入60 mL的FM。盖上槽盖并拧紧螺丝固定。在30 °C、200 rpm条件下孵育12–16小时。
    注意：震荡过程中必须确保透析槽保持直立状态，否则将影响低分子量化合物的交换效率。 
  5. 第2天： 使用注射器从透析盒中吸出RM。将RM转移至新的离心管中，在4 °C、16,000 x g 条件下离心10分钟，以去除沉淀物。将上清液转移至新的离心管中。此时，上清液中的蛋白质可进一步分析。
    注意：某些情况下，离心后可见沉淀。该沉淀可能提供有关所分析纳米盘或反应化合物是否有助于维持目标膜蛋白（MP）可溶性的重要信息。因此，建议通过SDS-PAGE、Western Blot或直接观察沉淀大小，分析沉淀中可能存在的目标蛋白含量。

6. 用于 Mg2+ 离子筛选的分析级 60 µL CECF 反应体系设置

  1. 第1天：混合相应3倍浓缩母液的所有组分，取60 µL加入反应混合物（RM），825 µL加入流动混合物（FM）。用H2O补足FM体积，并通过涡旋振荡充分混匀。将FM转移至24孔微孔板中的3个孔内（表5）。
    注意：由于定制的Mini-CECF容器可能不易获得，表5中的体积是基于透析盒（10–14 kDa截留分子量，RM体积为100 µL）在96深孔（2 mL）板中进行反应而计算的，FM体积为1.7 mL（图1）。
  2. 将截留分子量为10–14 kDa的再生纤维素透析管剪成约25 × 20 mm大小的片状，并保存于含0.05%（w/v）叠氮化钠的H2O中。
    警告：叠氮化钠具有高毒性，避免与皮肤或黏膜接触。请勿使用金属容器，因为叠氮化钠可与金属反应生成易爆的金属叠氮化物。
  3. 在组装Mini-CECF容器前，用纸巾去除透析膜表面多余的H2O。将一片透析膜置于每个容器上，并用聚四氟乙烯环固定膜片。
  4. 将Mini-CECF容器放入含有825 µL FM的24孔板的孔中。注意避免Mini-CECF容器透析膜下方产生气泡。
  5. 按照说明将高分子量组分加入RM（表5），并通过反复吹打混匀。取60 µL加入反应容器中。转移黏稠溶液时应避免产生气泡。
  6. 裁剪两张8 × 10 cm的热封塑料膜，将装有反应容器的24孔板包裹起来，以减少反应混合物的蒸发。然后盖上细胞培养板盖，并用胶带固定。将板置于30 °C、200 rpm振荡条件下孵育12–16小时。
  7. 第2天：用移液枪头刺穿Mini-CECF容器中的透析膜，吸取RM以收集反应产物。将RM转移至新的离心管中，在4 °C、16,000 × g条件下离心10分钟以去除沉淀物。将上清液转移至新的离心管中。此时可对上清液中的蛋白质进行进一步分析。
    注意：某些情况下，离心后可见沉淀。这可能提供有关所分析的纳米盘或其他反应组分是否能有效维持合成膜蛋白（MP）可溶性的重要信息。因此，建议通过SDS-PAGE、Western Blot或直接观察沉淀大小来分析沉淀中可能存在的目标蛋白含量。

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结果

通过合成 MPs 的最终产率或质量，可以例证优化反应组分的影响。一种常见的常规方法是通过表达绿色荧光蛋白（GFP）来监测系统效率，从而调整无细胞反应中 Mg2+ 的最佳浓度。例如，在 14 至 24 mM 的 Mg2+ 浓度范围内，利用 pET-21a(+) 载体合成了 GFP（图 2）。SDS-PAGE 分析确定最佳 Mg2+ 浓度为 20 mM（图 2A），这与对无细胞反应上清液进行的互补荧光测定结果（激发波长 485 nm，发射波长 535 nm）高度一致（图 2B）。对于由 pIVEX 2.3 载体表达的细菌 PR 以及由 pET-21a(+) 载体表达的火鸡 β1 肾上腺素受体（Tβ1AR），其最佳 Mg2+ 浓度确定为 20–22 mM。

作为进一步的示例，展示了...

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讨论

优化细胞-free表达及功能性膜蛋白共翻译插入纳米盘的设置与策略。所需设备包括生物反应器、法国压汁机或类似装置、紫外/可见光及荧光读板仪、适用于双室构型配置的细胞-free反应容器，以及温度可控的培养箱。其他标准设备包括用于收获的离心机 E. coli 细胞以及转速至少达到 30,000 x 的台式离心机 g 用于制备S30裂解物。若需制备S80-S100裂解物，则需要超速离心机。所列设备在生物化学实验室中常规配备，开展无细胞表达实验无需较大的初期投入。此外，无需进行发酵及处理 E. coli 用于制备无细胞裂解液和T7 RNA聚合酶的细胞是常见且稳健的技术。其中成本最高的组分是无细胞裂解液、T7 RNA聚合酶和纳米盘，这些组分可通过可靠且高效的方案制备，分装后在-80℃可稳定保存数年 °C. CF 裂解物和 T7RNAP 的制备各需要三天，MSP 的表达与纯化以及纳米盘的制备大约需要一周时间。靶标模板 DNA 可使用 pET-21、pIVEX 或类似的载体系统提供。在构建和优化 CF 表达系统时，可通过表达 GFP 变体（如位移型 GFP（GFP+）或超折叠 GFP（su...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

我们感谢德国研究基金会（DFG）项目资助 BE1911/8-1、LOEWE 项目 GLUE 以及膜间转运与通讯合作研究中心（SFB807）提供的经费支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
1,2-二肉豆蔻酰-sn-甘油-3-磷酸-(1'-外消旋-甘油)（钠盐）（DMPG）Avanti Polar Lipids (美国)840445P
1,2-二肉豆蔻酰-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱（DMPC）Avanti Polar Lipids (美国)850345C
1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱（钠盐）（DOPC）Avanti Polar Lipids (美国)850375C
1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸-rac-(1-甘油)（钠盐）（DOPG）Avanti Polar Lipids (美国)840475C
1-棕榈酰-2-油酰-甘油-3-磷脂酰胆碱（POPC）Avanti Polar Lipids (美国)850457C
1-棕榈酰-2-油酰-sn-甘油-3-磷酸-(1'-外消旋-甘油)（钠盐）（POPG）Avanti Polar Lipids (美国)840034C
2-氨基-2-(羟甲基)-丙烷-1,3-二醇（Tris）Carl Roth (德国)4855
2-巯基乙醇Carl Roth (德国)4227
2-丙醇Carl Roth (德国)9781
[3H]-二氢阿普洛尔盐酸盐American Radiolabeled Chemicals (美国)ART0134
乙酰磷酸锂钾盐（ACP）Merck (德国)1409
腺苷5’-三磷酸（ATP）Sigma Aldrich (德国)A9251
阿普洛尔盐酸盐Merck (德国)A0360000
阴离子交换层析柱材料：Q-Sepharose®Sigma-Aldrich (德国)Q1126
高压灭菌器 GE 446EC-1 型Getinge (德国)
生物反应器 884 124/1 型B.Braun (德国)
离心机Sorvall RC12BP+；Thermo Scientific (德国)；Sorvall RC-5C；Thermo Scientific (德国)；Mikro 22 R；Hettich (德国)
胆酸Carl Roth (德国)8137
考马斯亮蓝 R250Carl Roth (德国)3862
细胞培养瓶：500 ml 带挡板培养瓶，2 L 带挡板培养瓶Schott Duran (德国)
胞苷5'-三磷酸二钠盐Sigma-Aldrich (德国)C1506
D-葡萄糖一水合物Carl Roth (德国)6780
二水合磷酸氢二钾Carl Roth (德国)6878
透析管 SpectrumTM Labs Spectra/PorTM 12-14 kD 截留分子量标准再生纤维素管Fisher Scientific (德国)8700152
二硫苏糖醇Carl Roth (德国)6908
乙醇Carl Roth (德国)K928
亚叶酸钙盐水合物Sigma-Aldrich (德国)47612
法国式高压细胞破碎仪SLM；Amico Instruments (美国)
甘油Carl Roth (德国)3783
鸟苷5'-三磷酸二钠盐（GTP）Sigma-Aldrich (德国)G8877
盐酸Carl Roth (德国)K025
IMAC 柱：HiTrap IMAC HP 5 mLGE Life Sciences (德国)GE17-5248
咪唑Carl Roth (德国)3899
异丙基-β-D-硫代半乳糖吡喃糖苷（IPTG）Carl Roth (德国)2316
卡那霉素Carl Roth (德国)T832
L-丙氨酸Carl Roth (德国)3076.1
L-精氨酸Carl Roth (德国)6908
L-天冬酰胺Carl Roth (德国)HN23
L-天冬氨酸Carl Roth (德国)T202
L-半胱氨酸Carl Roth (德国)T203
L-谷氨酸Carl Roth (德国)3774
L-谷氨酰胺Carl Roth (德国)3772
L-甘氨酸Carl Roth (德国)3187
L-组氨酸Carl Roth (德国)3852
L-异亮氨酸Carl Roth (德国)3922
L-亮氨酸Carl Roth (德国)1699
L-赖氨酸Carl Roth (德国)4207
L-甲硫氨酸Carl Roth (德国)9359
L-脯氨酸Carl Roth (德国)1713
L-苯丙氨酸Carl Roth (德国)1709
L-丝氨酸Carl Roth (德国)4682
L-苏氨酸Carl Roth (德国)1738
L-色氨酸Carl Roth (德国)7700
L-酪氨酸Carl Roth (德国)T207
MD100 透析装置Scienova (德国)40077
N-2-羟乙基哌嗪-N'-2-乙磺酸（HEPES）Carl Roth (德国)6763
n-十二烷基磷脂酰胆碱Antrace (美国)F308S
PAGE 电泳槽：Mini-Protean Tetra CellBiorad (德国)
PAGE 凝胶制备系统：Mini Protean Handcast 系统Biorad (德国)
PAGE 凝胶电源：Power Pac 3000Biorad (德国)
酪蛋白来源的胰蛋白胨/蛋白胨Carl Roth (德国)6681
蠕动泵：ip-12Ismatec (德国)
磷酸烯醇式丙酮酸单钾盐Sigma Aldrich (德国)860077
磷酸二氢钾Carl Roth (德国)P018
乙酸钾Carl Roth (德国)4986
氯化钾Carl Roth (德国)6781
丙酮酸激酶Roche (德国)10109045001
液体闪烁计数器：Hidex 300 SLHidex (芬兰)
SDS 片剂Carl Roth (德国)8029
叠氮化钠Sigma-Aldrich (德国)K305
氯化钠Carl Roth (德国)P029
分光光度计 NanodropPeqlab (德国)
分光光度计/荧光读板仪 Spark®Tecan (瑞士)
tRNA（大肠杆菌来源）Roche (德国)10109550001
超声破碎仪Labsonic U, B. Braun (德国)
尿苷5’-三磷酸三钠盐（UTP）Sigma-Aldrich (德国)U6625
Y-30 消泡剂Sigma-Aldrich (德国)A6457
酵母提取物Carl Roth (德国)2904

参考文献

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