Burada, önceden ayırt edilmiş insan kaynaklı pluripotent kök hücre türevli kardiyomiyositler, kardiyak fibroblastlar ve endotel hücrelerinden oluşan 3D kendi kendine monte edilmiş kardiyak mikrotissue dizileri oluşturmak için kullanımı kolay bir metodolojiyi açıklıyoruz. Kardiyak mikrotissues üretmek için teknik gerektiren bu kullanıcı dostu ve düşük hücre, hastalık modellemesi ve ilaç gelişiminin erken aşamaları için uygulanabilir.
İndüklenmiş pluripotent kök hücrelerden (IPSC) insan kardiyomiyositleri (CD), kardiyak fibroblastlar (KF’ler) ve endotel hücrelerinin (VC) üretilmesi, doku gelişimini ve hastalığı yönlendiren farklı kardiyovasküler hücre tipleri arasındaki karmaşık etkileşimi incelemek için eşsiz bir fırsat sağlamıştır. Kardiyak doku modelleri alanında, çeşitli sofistike üç boyutlu (3D) yaklaşımlar, hücre dışı matrisler ve çapraz bağlantıların bir kombinasyonu ile fizyolojik alaka düzeyini ve doğal doku ortamını taklit etmek için indüklenmiş pluripotent kök hücre türevi kardiyomiyositler (iPSC-CMs) kullanır. Bununla birlikte, bu sistemler mikrofabrikasyon uzmanlığı olmadan üretilmek için karmaşıktır ve kendi kendine monte etmek için birkaç hafta gerektirir. En önemlisi, bu sistemlerin çoğu, insan kalbindeki nonmyositlerin% 60’ından fazlasını oluşturan vasküler hücrelerden ve kardiyak fibroblastlardan yoksundur. Burada, her üç kardiyak hücre tipinin de iPSC’lerden kardiyak mikrotizeler uzaması için türetmelerini açıklıyoruz. Bu facile replika kalıplama tekniği, standart çok kuyulu hücre kültürü plakalarında birkaç hafta boyunca kardiyak mikrotissue kültürüne izin verir. Platform, ilk tohumlama yoğunluğuna göre mikrotissue boyutları üzerinde kullanıcı tanımlı kontrol sağlar ve gözlemlenebilir kardiyak mikrotissue kasılmalarının elde etmek için kendi kendine montajı için 3 günden az bir süre gerekir. Ayrıca, kardiyak mikrotissular akış sitometrisi ve tek hücreli RNA dizilimi (scRNA-seq) kullanılarak tek hücreli sorgulama için yüksek hücre canlılığını korurken kolayca sindirilebilir. Kardiyak mikrotissuların bu in vitro modelinin ilaç keşfi ve hastalık modellemesinde doğrulama çalışmalarını hızlandırmaya yardımcı olacağını öngörüyoruz.
Kardiyovasküler araştırma alanında ilaç keşfi ve hastalık modellemesi, klinik olarak ilgili örneklerin eksikliği ve yetersiz çeviri araçları nedeniyle çeşitli zorluklarla karşı karşıyadır1. Son derece karmaşık klinik öncesi modeller veya aşırı basitleştirilmiş in vitro tek hücreli modeller tekrarlanabilir bir şekilde patofizyolojik koşullar sergilemez. Bu nedenle, birkaç minyatürleştirilmiş doku mühendisliği platformu, yüksek verimli bir şekilde uygulama kolaylığı ile doku fonksiyonunun sadık bir şekilde yeniden kesilmesi arasında bir denge sağlamak amacıyla boşluğu kapatmaya yardımcı olmak için evrimleşmiştir2,3. İndüklenmiş pluripotent kök hücre (iPSC) teknolojisinin ortaya çıkmasıyla, doku mühendisliği araçları araştırma sorularını yanıtlamak için altta yatan kardiyovasküler hastalık durumu olan veya olmayan hastaya özgü hücrelere uygulanabilir4,5,6. Kalp dokusuna benzer hücresel bileşime sahip bu tür doku mühendisliği modelleri, bir veya birden fazla hücre tipinin davranışındaki patolojik değişikliklerin neden olduğu kardiyotoksikliği ve disfonksiyonu test etmek için ilaç geliştirme çabalarında kullanılabilir.
İnsan iPSC’lerinden elde edilen kendi kendine monte edilen mikrotissues veya organoidler, in vivo meslektaşlarıyla fonksiyonel benzerlikler gösteren minyatür doku benzeri derlemeler olan üç boyutlu (3D) yapılardır. IPSC’lerin yönlendirilmiş farklılaşması veya embriyoid cisimlerin oluşumu yoluyla in situ organoidlerin oluşumuna izin veren birkaç farklı yaklaşım vardır4. Elde eden organoidler, organogenezini yönlendiren morfogenetik süreçleri incelemek için vazgeçilmez bir araçtır. Bununla birlikte, çeşitli hücre popülasyonlarının varlığı ve öz örgütlenmedeki farklılıklar, farklı organoidler arasındaki sonuçlarda değişkenliğe yol açabilir5. Alternatif olarak, yerel hücre-hücre etkileşimlerini incelemek için dokuya özgü hücre tiplerine sahip mikrotizelere kendi kendine monte edilen önceden ayırt edilmiş hücreler, kendi kendine monte edilen bileşenleri izole etmenin mümkün olduğu mükemmel modellerdir. Özellikle insan kardiyak araştırmalarında, hücreler farklı hasta hatlarından veya ticari kaynaklardan türetildiğinde, çok hücreli bileşenlere sahip 3D kardiyak mikrotizelerin geliştirilmesinin zor olduğu kanıtlanmıştır.
Fizyolojik olarak ilgili, kişiselleştirilmiş, in vitro modelde hücre davranışlarına ilişkin mekanistik anlayışımızı geliştirmek için ideal olarak tüm bileşen hücre tipleri aynı hasta hattından türetilmelidir. bir insan kalbi bağlamında, gerçekten temsili bir kardiyak in vitro modeli baskın hücre tipleri arasında çapraz sapı yakalar, yani kardiyomiyositler (CD), endotel hücreleri (VC’ler) ve kardiyak fibroblastlar (KF’ler)6,7. Bir miyokardın sadık rekapitülasyonu sadece biyofiziksel streç ve elektrofizyolojik stimülasyon değil, aynı zamanda VC’ler ve CCS8 gibi hücre tiplerinin desteklenmesinden kaynaklanan hücre-hücre sinyali gerektirir. CF’ler hücre dışı matris sentezinde ve doku yapısının korunmasında rol oynar; ve patolojik bir durumda, CF’ler FIBROZIs’a neden olabilir ve CMs9’daki elektrik iletimini değiştirebilir. Benzer şekilde, VC’ler parakrin sinyalizasyon ve hayati metabolik talepler sağlayarak CD’lerin kontrtil özelliklerini düzenleyebilir10. Bu nedenle, fizyolojik olarak ilgili yüksek verimli deneylerin yapılmasına izin vermek için üç ana hücre tipinden oluşan insan kardiyak mikrotizelerine ihtiyaç vardır.
Burada, insan iPSC türevi kardiyomiyositler (iPSC-CM’ler), iPSC türevi endotel hücreleri (iPSC-ECs) ve iPSC türevi kardiyak fibroblastlar (iPSC-CF’ler) ve 3D kültürlerinin tekdüze kardiyak mikrotissue dizilerinde türetilerek kardiyak mikrotissuların imalatında aşağıdan yukarıya bir yaklaşım açıklıyoruz. Kendiliğinden atan kardiyak mikrotizeler üretmenin bu facile yöntemi, kalp fizyolojisinin fonksiyonel ve mekanistik anlaşılması için hastalıkların modellemesi ve ilaçların hızlı testi için kullanılabilir. Ayrıca, bu tür çok hücreli kardiyak mikrotissue platformları, kronik veya akut kültür koşullarında kardiyak hastalığın zaman içinde ilerlemesini taklit etmek için genom düzenleme teknikleri ile kullanılabilir.
Önceden ayırt edilmiş iPSC-CM’lerden, iPSC-EC’lerden ve iPSC-CF’lerden kardiyak mikrotissues üretmek için, kardiyak mikrotizeler içinde temasla inhibe edilen hücre sıkışmasından sonra hücre numaralarının daha iyi kontrol altına alınması için son derece saf bir kültür elde etmek önemlidir. Son zamanlarda, Giacomelli ve. al.18 , iPSC-CM’ler, iPSC-EC’ler ve iPSC-CF’ler kullanılarak kardiyak mikrotissuların imalatını göstermiştir. Açıklanan yöntem kullanılarak oluşturul…
The authors have nothing to disclose.
Dr. Amanda Chase’e el yazması hakkındaki yararlı geri bildirimleri için teşekkür ederiz. Finansman desteği Kaliforniya Üniversitesi Tütünle İlgili Hastalık Araştırma Programı (TRDRP), T29FT0380 (D.T.) ve 27IR-0012 (J.C.W.) tarafından sağlanmıştır; Amerikan Kalp Derneği 20POST35210896 (H.K.) ve 17MERIT33610009 (J.C.W.); ve Ulusal Sağlık Enstitüleri (NIH) R01 HL126527, R01 HL123968, R01 HL150693, R01 HL141851 ve NIH UH3 TR002588 (J.C.W).
12-well plates | Fisher Scientific | 08-772-29 | |
3D micro-molds | Microtissues | 12-81 format | |
6-well plates | Fisher Scientific | 08-772-1B | |
AutoMACS Rinsing Solution | Thermo Fisher Scientific | NC9104697 | |
B27 Supplement minus Insulin | Life Technologies | A1895601 | |
B27 Supplement plus Insulin | Life Technologies | 17504-044 | |
BD Cytofix | BD Biosciences | 554655 | |
BD Matrigel, hESC-qualified matrix | BD Biosciences | 354277 | |
Cardiac Troponin T Antibody | Miltenyi | 130-120-403 | |
CD144 (VE-Cadherin) MicroBeads | Miltenyi | 130-097-857 | |
CD31 Antibody | Miltenyi | 130-110-670 | |
CD31 Microbeads | Miltenyi | 130-091-935 | |
CHIR-99021 | Selleckchem | S2924 | |
DDR2 | Santa Cruz Biotechnology | sc-81707 | |
Dead Cell Apoptosis Kit with Annexin V FITC and PI | Thermo Fisher Scientific | V13242 | |
Dispase I | Millipore Sigma | 4942086001 | |
DMEM, high glucose (4.5g/L) no glutamine medium | 11960044 | ||
DMEM/F-12 basal medium | Gibco | 11320033 | |
Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS), no calcium, no magnesium | Life Technologies | 14190-136 | |
EGM2 BulletKit | Lonza | CC-3124 | |
Fetal bovine serum | Life Technologies | 10437 | |
FibroLife Serum-Free Fibroblast LifeFactors Kit | LifeLIne Cell Technology | LS-1010 | |
Glucose free RPMI medium | Life Technologies | 11879-020 | |
Goat serum | Life Technologies | 16210-064 | |
Human FGF-basic | Thermo Fisher Scientific | 13256029 | |
Human VEGF-165 | PeproTech | 100-20 | |
IWR-1-endo | Selleckchem | S7086 | |
Liberase TL | Millipore Sigma | 5401020001 | |
LS Sorting Columns | Miltenyi | 130-042-401 | |
MACS BSA Stock solution | Miltenyi | 130-091-376 | |
MACS Rinsing Buffer | Miltenyi | 130-091-222 | |
MidiMACS Separator | Miltenyi | 130-042-302 | |
RPMI medium | Life Technologies | 11835055 | |
SB431542 | Selleckchem | S1067 | |
TO-PRO 3 | Thermo Fisher Scientific | R37170 | |
Triton X-100 | Millipore Sigma | X100-100ML | |
TrypLE Select 10X | Thermo Fisher Scientific | red | |
Vimentin Alexa Fluor® 488-conjugated Antibody | R&D Systems | IC2105G |