İnsan iPSC Türevli Kardiyomiyositler, Kardiyak Fibroblastlar ve Endotel Hücreleri Kullanılarak 3D Kardiyak Mikrotissue Dizilerinin İmalatı
Summary
Burada, önceden ayırt edilmiş insan kaynaklı pluripotent kök hücre türevli kardiyomiyositler, kardiyak fibroblastlar ve endotel hücrelerinden oluşan 3D kendi kendine monte edilmiş kardiyak mikrotissue dizileri oluşturmak için kullanımı kolay bir metodolojiyi açıklıyoruz. Kardiyak mikrotissues üretmek için teknik gerektiren bu kullanıcı dostu ve düşük hücre, hastalık modellemesi ve ilaç gelişiminin erken aşamaları için uygulanabilir.
Abstract
İndüklenmiş pluripotent kök hücrelerden (IPSC) insan kardiyomiyositleri (CD), kardiyak fibroblastlar (KF’ler) ve endotel hücrelerinin (VC) üretilmesi, doku gelişimini ve hastalığı yönlendiren farklı kardiyovasküler hücre tipleri arasındaki karmaşık etkileşimi incelemek için eşsiz bir fırsat sağlamıştır. Kardiyak doku modelleri alanında, çeşitli sofistike üç boyutlu (3D) yaklaşımlar, hücre dışı matrisler ve çapraz bağlantıların bir kombinasyonu ile fizyolojik alaka düzeyini ve doğal doku ortamını taklit etmek için indüklenmiş pluripotent kök hücre türevi kardiyomiyositler (iPSC-CMs) kullanır. Bununla birlikte, bu sistemler mikrofabrikasyon uzmanlığı olmadan üretilmek için karmaşıktır ve kendi kendine monte etmek için birkaç hafta gerektirir. En önemlisi, bu sistemlerin çoğu, insan kalbindeki nonmyositlerin% 60’ından fazlasını oluşturan vasküler hücrelerden ve kardiyak fibroblastlardan yoksundur. Burada, her üç kardiyak hücre tipinin de iPSC’lerden kardiyak mikrotizeler uzaması için türetmelerini açıklıyoruz. Bu facile replika kalıplama tekniği, standart çok kuyulu hücre kültürü plakalarında birkaç hafta boyunca kardiyak mikrotissue kültürüne izin verir. Platform, ilk tohumlama yoğunluğuna göre mikrotissue boyutları üzerinde kullanıcı tanımlı kontrol sağlar ve gözlemlenebilir kardiyak mikrotissue kasılmalarının elde etmek için kendi kendine montajı için 3 günden az bir süre gerekir. Ayrıca, kardiyak mikrotissular akış sitometrisi ve tek hücreli RNA dizilimi (scRNA-seq) kullanılarak tek hücreli sorgulama için yüksek hücre canlılığını korurken kolayca sindirilebilir. Kardiyak mikrotissuların bu in vitro modelinin ilaç keşfi ve hastalık modellemesinde doğrulama çalışmalarını hızlandırmaya yardımcı olacağını öngörüyoruz.
Introduction
Kardiyovasküler araştırma alanında ilaç keşfi ve hastalık modellemesi, klinik olarak ilgili örneklerin eksikliği ve yetersiz çeviri araçları nedeniyle çeşitli zorluklarla karşı karşıyadır1. Son derece karmaşık klinik öncesi modeller veya aşırı basitleştirilmiş in vitro tek hücreli modeller tekrarlanabilir bir şekilde patofizyolojik koşullar sergilemez. Bu nedenle, birkaç minyatürleştirilmiş doku mühendisliği platformu, yüksek verimli bir şekilde uygulama kolaylığı ile doku fonksiyonunun sadık bir şekilde yeniden kesilmesi arasında bir denge sağlamak amacıyla boşluğu kapatmaya yardımcı olmak için evrimleşmiştir2,3. İndüklenmiş pluripotent kök hücre (iPSC) teknolojisinin ortaya çıkmasıyla, doku mühendisliği araçları araştırma sorularını yanıtlamak için altta yatan kardiyovasküler hastalık durumu olan veya olmayan hastaya özgü hücrelere uygulanabilir4,5,6. Kalp dokusuna benzer hücresel bileşime sahip bu tür doku mühendisliği modelleri, bir veya birden fazla hücre tipinin davranışındaki patolojik değişikliklerin neden olduğu kardiyotoksikliği ve disfonksiyonu test etmek için ilaç geliştirme çabalarında kullanılabilir.
İnsan iPSC’lerinden elde edilen kendi kendine monte edilen mikrotissues veya organoidler, in vivo meslektaşlarıyla fonksiyonel benzerlikler gösteren minyatür doku benzeri derlemeler olan üç boyutlu (3D) yapılardır. IPSC’lerin yönlendirilmiş farklılaşması veya embriyoid cisimlerin oluşumu yoluyla in situ organoidlerin oluşumuna izin veren birkaç farklı yaklaşım vardır4. Elde eden organoidler, organogenezini yönlendiren morfogenetik süreçleri incelemek için vazgeçilmez bir araçtır. Bununla birlikte, çeşitli hücre popülasyonlarının varlığı ve öz örgütlenmedeki farklılıklar, farklı organoidler arasındaki sonuçlarda değişkenliğe yol açabilir5. Alternatif olarak, yerel hücre-hücre etkileşimlerini incelemek için dokuya özgü hücre tiplerine sahip mikrotizelere kendi kendine monte edilen önceden ayırt edilmiş hücreler, kendi kendine monte edilen bileşenleri izole etmenin mümkün olduğu mükemmel modellerdir. Özellikle insan kardiyak araştırmalarında, hücreler farklı hasta hatlarından veya ticari kaynaklardan türetildiğinde, çok hücreli bileşenlere sahip 3D kardiyak mikrotizelerin geliştirilmesinin zor olduğu kanıtlanmıştır.
Fizyolojik olarak ilgili, kişiselleştirilmiş, in vitro modelde hücre davranışlarına ilişkin mekanistik anlayışımızı geliştirmek için ideal olarak tüm bileşen hücre tipleri aynı hasta hattından türetilmelidir. bir insan kalbi bağlamında, gerçekten temsili bir kardiyak in vitro modeli baskın hücre tipleri arasında çapraz sapı yakalar, yani kardiyomiyositler (CD), endotel hücreleri (VC’ler) ve kardiyak fibroblastlar (KF’ler)6,7. Bir miyokardın sadık rekapitülasyonu sadece biyofiziksel streç ve elektrofizyolojik stimülasyon değil, aynı zamanda VC’ler ve CCS8 gibi hücre tiplerinin desteklenmesinden kaynaklanan hücre-hücre sinyali gerektirir. CF’ler hücre dışı matris sentezinde ve doku yapısının korunmasında rol oynar; ve patolojik bir durumda, CF’ler FIBROZIs’a neden olabilir ve CMs9’daki elektrik iletimini değiştirebilir. Benzer şekilde, VC’ler parakrin sinyalizasyon ve hayati metabolik talepler sağlayarak CD’lerin kontrtil özelliklerini düzenleyebilir10. Bu nedenle, fizyolojik olarak ilgili yüksek verimli deneylerin yapılmasına izin vermek için üç ana hücre tipinden oluşan insan kardiyak mikrotizelerine ihtiyaç vardır.
Burada, insan iPSC türevi kardiyomiyositler (iPSC-CM’ler), iPSC türevi endotel hücreleri (iPSC-ECs) ve iPSC türevi kardiyak fibroblastlar (iPSC-CF’ler) ve 3D kültürlerinin tekdüze kardiyak mikrotissue dizilerinde türetilerek kardiyak mikrotissuların imalatında aşağıdan yukarıya bir yaklaşım açıklıyoruz. Kendiliğinden atan kardiyak mikrotizeler üretmenin bu facile yöntemi, kalp fizyolojisinin fonksiyonel ve mekanistik anlaşılması için hastalıkların modellemesi ve ilaçların hızlı testi için kullanılabilir. Ayrıca, bu tür çok hücreli kardiyak mikrotissue platformları, kronik veya akut kültür koşullarında kardiyak hastalığın zaman içinde ilerlemesini taklit etmek için genom düzenleme teknikleri ile kullanılabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Önceden ayırt edilmiş iPSC-CM’lerden, iPSC-EC’lerden ve iPSC-CF’lerden kardiyak mikrotissues üretmek için, kardiyak mikrotizeler içinde temasla inhibe edilen hücre sıkışmasından sonra hücre numaralarının daha iyi kontrol altına alınması için son derece saf bir kültür elde etmek önemlidir. Son zamanlarda, Giacomelli ve. al.18 , iPSC-CM’ler, iPSC-EC’ler ve iPSC-CF’ler kullanılarak kardiyak mikrotissuların imalatını göstermiştir. Açıklanan yöntem kullanılarak oluşturul…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dr. Amanda Chase’e el yazması hakkındaki yararlı geri bildirimleri için teşekkür ederiz. Finansman desteği Kaliforniya Üniversitesi Tütünle İlgili Hastalık Araştırma Programı (TRDRP), T29FT0380 (D.T.) ve 27IR-0012 (J.C.W.) tarafından sağlanmıştır; Amerikan Kalp Derneği 20POST35210896 (H.K.) ve 17MERIT33610009 (J.C.W.); ve Ulusal Sağlık Enstitüleri (NIH) R01 HL126527, R01 HL123968, R01 HL150693, R01 HL141851 ve NIH UH3 TR002588 (J.C.W).
Materials
| 12-well plates | Fisher Scientific | 08-772-29 | |
| 3D micro-molds | Microtissues | 12-81 format | |
| 6-well plates | Fisher Scientific | 08-772-1B | |
| AutoMACS Rinsing Solution | Thermo Fisher Scientific | NC9104697 | |
| B27 Supplement minus Insulin | Life Technologies | A1895601 | |
| B27 Supplement plus Insulin | Life Technologies | 17504-044 | |
| BD Cytofix | BD Biosciences | 554655 | |
| BD Matrigel, hESC-qualified matrix | BD Biosciences | 354277 | |
| Cardiac Troponin T Antibody | Miltenyi | 130-120-403 | |
| CD144 (VE-Cadherin) MicroBeads | Miltenyi | 130-097-857 | |
| CD31 Antibody | Miltenyi | 130-110-670 | |
| CD31 Microbeads | Miltenyi | 130-091-935 | |
| CHIR-99021 | Selleckchem | S2924 | |
| DDR2 | Santa Cruz Biotechnology | sc-81707 | |
| Dead Cell Apoptosis Kit with Annexin V FITC and PI | Thermo Fisher Scientific | V13242 | |
| Dispase I | Millipore Sigma | 4942086001 | |
| DMEM, high glucose (4.5g/L) no glutamine medium | 11960044 | ||
| DMEM/F-12 basal medium | Gibco | 11320033 | |
| Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS), no calcium, no magnesium | Life Technologies | 14190-136 | |
| EGM2 BulletKit | Lonza | CC-3124 | |
| Fetal bovine serum | Life Technologies | 10437 | |
| FibroLife Serum-Free Fibroblast LifeFactors Kit | LifeLIne Cell Technology | LS-1010 | |
| Glucose free RPMI medium | Life Technologies | 11879-020 | |
| Goat serum | Life Technologies | 16210-064 | |
| Human FGF-basic | Thermo Fisher Scientific | 13256029 | |
| Human VEGF-165 | PeproTech | 100-20 | |
| IWR-1-endo | Selleckchem | S7086 | |
| Liberase TL | Millipore Sigma | 5401020001 | |
| LS Sorting Columns | Miltenyi | 130-042-401 | |
| MACS BSA Stock solution | Miltenyi | 130-091-376 | |
| MACS Rinsing Buffer | Miltenyi | 130-091-222 | |
| MidiMACS Separator | Miltenyi | 130-042-302 | |
| RPMI medium | Life Technologies | 11835055 | |
| SB431542 | Selleckchem | S1067 | |
| TO-PRO 3 | Thermo Fisher Scientific | R37170 | |
| Triton X-100 | Millipore Sigma | X100-100ML | |
| TrypLE Select 10X | Thermo Fisher Scientific | red | |
| Vimentin Alexa Fluor® 488-conjugated Antibody | R&D Systems | IC2105G |
References
- Neofytou, E., O’Brien, C. G., Couture, L. A., Wu, J. C. Hurdles to clinical translation of human induced pluripotent stem cells. Journal of Clinical Investigation. 125 (7), 2551-2557 (2015).
- Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Organogenesis in a dish: Modeling development and disease using organoid technologies. Science. 345 (6194), 1247125 (2014).
- Liu, C., Oikonomopoulos, A., Sayed, N., Wu, J. C. Modeling human diseases with induced pluripotent stem cells: from 2D to 3D and beyond. Development. 145 (5), 156166 (2018).
- Yin, X., Mead, B. E., Safaee, H., Langer, R., Karp, J. M., Levy, O. Engineering stem cell organoids. Cell Stem Cell. 18 (1), 25-38 (2016).
- Giacomelli, E., et al. Three-dimensional cardiac microtissues composed of cardiomyocytes and endothelial cells co-differentiated from human pluripotent stem cells. Development. 144 (6), 1008-1017 (2017).
- Kurokawa, Y. K., George, S. C. Tissue engineering the cardiac microenvironment: Multicellular microphysiological systems for drug screening. Advances in Drug Delivery Reviews. 96, 225-233 (2016).
- Cartledge, J. E., et al. Functional crosstalk between cardiac fibroblasts and adult cardiomyocytes by soluble mediators. Cardiovascular Research. 105 (3), 260-270 (2015).
- Ravenscroft, S. M., Pointon, A., Williams, A. W., Cross, M. J., Sidaway, J. E. Cardiac non-myocyte cells show enhanced pharmacological function suggestive of contractile maturity in stem cell derived cardiomyocyte microtissues. Toxicology Science. 152 (1), 99-112 (2016).
- Ieda, M., et al. Cardiac fibroblasts regulate myocardial proliferation through beta1 integrin signaling. Developmental Cell. 16 (2), 233-244 (2009).
- Brutsaert, D. L. Cardiac endothelial-myocardial signaling: its role in cardiac growth, contractile performance, and rhythmicity. Physiological Reviews. 83 (1), 59-115 (2003).
- Huebsch, N., et al. Automated video-based analysis of contractility and calcium flux in human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes cultured over different spatial scales. Tissue Engineering Part C Methods. 21 (5), 467-479 (2015).
- Burridge, P. W., et al. Chemically defined generation of human cardiomyocytes. Nature Methods. 11 (8), 855-860 (2014).
- Gu, M., et al. Pravastatin reverses obesity-induced dysfunction of induced pluripotent stem cell-derived endothelial cells via a nitric oxide-dependent mechanism. European Heart Journal. 36 (13), 806-816 (2015).
- Williams, I. M., Wu, J. C. Generation of endothelial cells from human pluripotent stem cells. Arteriosclerosis, Thrombosis and Vascular Biology. 39 (7), 1317-1329 (2019).
- Zhang, H., Shen, M., Wu, J. C. Generation of quiescent cardiac fibroblasts derived from human induced pluripotent stem cells. Methods in Molecular Biology. , 1-7 (2020).
- Zhang, H., et al. Generation of quiescent cardiac fibroblasts from human induced pluripotent stem cells for in vitro modeling of cardiac fibrosis. Circulation Research. 125 (5), 552-566 (2019).
- Zhang, J., et al. Functional cardiac fibroblasts derived from human pluripotent stem cells via second heart field progenitors. Nature Communications. 10 (1), 2238-2315 (2019).
- Giacomelli, E., et al. Human-iPSC-derived cardiac stromal cells enhance maturation in 3d cardiac microtissues and reveal non-cardiomyocyte contributions to heart disease. Cell Stem Cell. 26 (6), 862-879 (2020).
- Burridge, P. W., Holmström, A., Wu, J. C. Chemically defined culture and cardiomyocyte differentiation of human pluripotent stem cells. Current Protocols in Human Genetics. 87 (1), 1-15 (2015).
- Lian, X., et al. Directed cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells by modulating Wnt/β-catenin signaling under fully defined conditions. Nature Protocols. 8 (1), 162-175 (2013).
- Buikema, J. W., et al. Wnt activation and reduced cell-cell contact synergistically induce massive expansion of functional human iPSC-derived cardiomyocytes. Cell Stem Cell. 27 (1), 50-63 (2020).
- Feyen, D. A. M., et al. Metabolic maturation media improve physiological function of human iPSC-derived cardiomyocytes. Cell Reports. 32 (3), 107925 (2020).
- Karbassi, E., et al. Cardiomyocyte maturation: Advances in knowledge and implications for regenerative medicine. Nature Reviews Cardiology. 17 (6), 341-359 (2020).
- Li, Z., Hu, S., Ghosh, Z., Han, Z., Wu, J. C. Functional characterization and expression profiling of human induced pluripotent stem cell- and embryonic stem cell-derived endothelial cells. Stem Cells Development. 20 (10), 1701-1710 (2011).
- Lian, X., et al. Efficient differentiation of human pluripotent stem cells to endothelial progenitors via small-molecule activation of WNT signaling. Stem Cell Report. 3 (5), 804-816 (2014).
- Gu, M. Efficient differentiation of human pluripotent stem cells to endothelial cells. Current Protocols in Human Genetics. 98 (1), 64 (2018).
- Acharya, A., et al. The bHLH transcription factor Tcf21 is required for lineage-specific EMT of cardiac fibroblast progenitors. Development. 139 (12), 2139-2149 (2012).
- Wessels, A., et al. Epicardially derived fibroblasts preferentially contribute to the parietal leaflets of the atrioventricular valves in the murine heart. Development Biology. 366 (2), 111-124 (2012).
- Ali, S. R., et al. Developmental heterogeneity of cardiac fibroblasts does not predict pathological proliferation and activation. Circulation Research. 115 (7), 625-635 (2014).
- McMurtrey, R. J. Analytic and numerical models of oxygen and nutrient diffusion, metabolism dynamics, and architecture optimization in three-dimensional tissue constructs with applications and insights in cerebral organoids. Tissue Engineering Part C Methods. (3), 221-249 (2015).
- Thomas, D., O’Brien, T., Pandit, A. Toward customized extracellular niche engineering: progress in cell-entrapment technologies. Advanced Materials. 30 (1), 1703948 (2018).
- Thomas, D., Shenoy, S., Sayed, N. Building Multi-dimensional induced pluripotent stem cells-based model platforms to assess cardiotoxicity in cancer therapies. Front Pharmacol. 12, 39 (2021).
- Rhee, J. -. W., et al. Modeling secondary iron overload cardiomyopathy with human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Cell Reports. 32 (2), 107886 (2020).
- Paik, D. T., Cho, S., Tian, L., Chang, H. Y., Wu, J. C. Single-cell RNA sequencing in cardiovascular development, disease, and medicine. Nature Reviews Cardiology. 17 (8), 457-473 (2020).
- Nguyen, Q. H., Pervolarakis, N., Nee, K., Kessenbrock, K. Experimental considerations for single-cell RNA sequencing approaches. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 6, 108 (2018).
- Lau, E., Paik, D. T., Wu, J. C. Systems-wide approaches in induced pluripotent stem cell models. Annual Reviews in Pathology. 14 (1), 395-419 (2019).
- Maddah, M., et al. A non-invasive platform for functional characterization of stem-cell-derived cardiomyocytes with applications in cardiotoxicity testing. Stem Cell Report. 4 (4), 621-631 (2015).
- Sala, L., et al. Musclemotion: A versatile open software tool to quantify cardiomyocyte and cardiac muscle contraction in vitro and in vivo. Circulation Research. 122 (3), 5-16 (2018).
