Sand Fly (Phlebotomus papatasi) Microinjection embryonnaire pour CRISPR/Cas9 Mutagenesis
Summary
Ce protocole détaille les étapes de la mutagenèse ciblée CRISPR/Cas9 chez les mouches du sable : collecte d’embryons, injection, élevage et identification d’insectes ainsi que sélection de mutations d’intérêt.
Abstract
Les mouches du sable sont les vecteurs naturels des espèces de Leishmania, les parasites protozoaires produisant un large éventail de symptômes allant des lésions cutanées à la pathologie viscérale. Le décryptage de la nature des interactions vecteurs/parasites est d’une importance primordiale pour une meilleure compréhension de la transmission de la leishmaniose à leurs hôtes. Parmi les paramètres contrôlant la compétence des vecteurs de mouches du sable (c’est-à-dire leur capacité à transporter et à transmettre des agents pathogènes), il a été démontré que les paramètres intrinsèques à ces insectes jouent un rôle clé. La réponse immunitaire des insectes, par exemple, influe sur la compétence des vecteurs de mouches de sable à Leishmania. L’étude de ces paramètres a été limitée par l’absence de méthodes de modification de l’expression génétique adaptées à l’utilisation dans ces organismes non modèles. La downregulation des gènes par petit ARN interférant (SIRNA) est possible, mais en plus d’être techniquement difficile, le silence ne conduit qu’à une perte partielle de fonction, qui ne peut pas être transmise de génération en génération. La mutagenèse ciblée par la technologie CRISPR/Cas9 a récemment été adaptée à la mouche du sable phlebotomus papatasi. Cette technique conduit à la génération de mutations transmissibles dans un locus spécifiquement choisi, permettant d’étudier les gènes d’intérêt. Le système CRISPR/Cas9 repose sur l’induction de ruptures ciblées d’ADN à double brin, réparées plus tard soit par jointage final non homologue (NHEJ) soit par Homology Driven Repair (HDR). NHEJ se compose d’une simple fermeture de la rupture et conduit fréquemment à de petits événements d’insertion / suppression. En revanche, HDR utilise la présence d’une molécule d’ADN donneur partageant l’homologie avec l’ADN cible comme modèle de réparation. Ici, nous présentons une méthode de microinjection embryon de mouche du sable pour la mutagenèse ciblée par CRISPR/Cas9 à l’aide de NHEJ, qui est la seule technique de modification du génome adaptée aux vecteurs de mouches de sable à ce jour.
Introduction
Les maladies à transmission vectorielle sont une menace majeure pour la santé publique en constante évolution. Des centaines d’espèces vectorielles réparties dans des familles phylogéniques très distinctes (moustiques, tiques, puces) sont responsables de la transmission d’un grand nombre d’agents pathogènes microbiens, entraînant plus de 700 000 décès humains par an, selon l’Organisation mondiale de la santé. Parmi les insectes vecteurs, les mouches phlébotomines de sable (Diptera, Psychodidae) constituent un vaste groupe, avec 80 espèces vectorielles éprouvées présentant des traits phénotypiques distincts et des capacités vectorielles que l’on trouve dans différentes régions géographiques. Ils sont des vecteurs pour les parasites protozoaires du genre Leishmania,causant environ 1,3 million de nouveaux cas de Leishmaniose et entre 20.000 et 30.000 décès par an. Les résultats cliniques de Leishmaniases sont divers, avec des symptômes s’étendant des lésions cutanées auto-limitantes à la diffusion viscérale qui est mortelle en l’absence de traitement.
Les mouches du sable sont des insectes strictement terrestres. Leur cycle de vie, relativement long par rapport à d’autres Diptéra, dure jusqu’à trois mois, selon différents paramètres tels que la température, l’humidité et la nutrition. Il se compose d’un stade embryonnaire (6 à 11 jours), de quatre stades larvaux (d’une durée totale de 23 à 25 jours) et d’un stade pupal (9 à 10 jours) suivi de métamorphose, puis d’âge adulte. Les mouches de sable ont besoin d’un environnement humide et chaud pour l’élevage. Les mâles et les femelles se nourrissent de sucres, obtenus à l’état sauvage à partir de nectars floraux. Seules les femelles sont des mangeurs de sang, car elles ont besoin de protéines obtenues à partir de la farine de sang pour la productiond’œufs 1.
L’un des objectifs importants de la recherche est d’identifier la nature des interactions vecteurs/parasites qui mènent au développement d’infections transmissibles. Comme pour les autres insectes vecteurs, il a été démontré que les paramètres intrinsèques aux mouches du sable ont un impact sur leur compétence vectorielle, qui est définie comme leur capacité à transporter et à transmettre des agents pathogènes à leurs hôtes. Par exemple, l’expression des galectines par les cellules de midgut de mouche de sable de Phlebotomus papatasi, agissant comme récepteurs reconnaissant des composants parasites de surface, peut influencer directement leur compétence vectorielle pour Leishmania major2,3. La voie de réponse immunitaire d’insecte, insuffisance immunisée (IMD), est également cruciale pour la compétence de vecteur de mouche de sable de Phlebotomus papatasi pour le major de Leishmania4. Un rôle critique pour les voies de réponse immunitaire des insectes vecteurs dans le contrôle de leur transmission d’agents pathogènes infectieux a également été signalé chez les moustiques Aedes aegypti 5,6,7, dans la mouche tsé-tsé Glossina morsitans8, et chez les moustiques Anopheles gambiae 9,10.
Les études sur les interactions mouches dusable/leishmaniose ont été limitées par l’absence de méthodes de modification de l’expression génétique adaptées pour être utilisées chez ces insectes. Seule la downregulation des gènes par petit ARN interférant (siRNA) avait étéeffectuée 11,12,13,14 jusqu’à récemment. La technique, limitée par la mortalité associée à la microinjection des femelles adultes, ne conduit qu’à une perte partielle de fonction, qui ne peut se transmettre de génération en génération.
La technologie CRISPR/Cas9 a révolutionné la recherche génomique fonctionnelle dans des organismes non modèles tels que les mouches du sable. Modifié à partir du système immunitaire adaptatif chez les procaryotes pour la défense contre les bactériophages15,16, le système CRISPR Cas9 a été rapidement adapté comme un outil d’édition du génome pour les organismes eucaryotes supérieurs, y compris les insectes. Le principe de l’édition ciblée du génome CRISPR/Cas9 est basé sur la complémentarité d’un ARN guide unique (SGRNA) à un locus génomique spécifique. La nucléase Cas9 se lie à l’ARN sg et crée une rupture d’ADN à double brin (DSDNA) dans l’ADN génomique où le sgRNA s’associe à sa séquence complémentaire. Le complexe Cas9-sgRNA est guidé vers la séquence cible par 17 à 20 bases complémentaires dans le sgRNA au locus choisi, la rupture dsDNA peut alors être réparée par deux voies indépendantes : l’assemblage final non homologique (NHEJ) ou la réparation dirigée par homologie (HDR)17. La réparation de NHEJ implique une simple fermeture de la rupture mais mène fréquemment à de petits événements d’insertion/suppression. La réparation de l’ADN par HDR utilise une molécule d’ADN donneur partageant l’homologie avec l’ADN cible comme modèle de réparation. Les insectes possèdent les deux machines.
La technologie CRISPR/Cas9 peut générer des mutations dans un lieu choisi, par la voie de réparation du NHEJ; ou pour des stratégies d’édition du génome plus complexes, telles que les knock-ins ou les reporters d’expression, par le biais de la voie HDR avec un modèle de donneur approprié. Chez les mouches de sable, des allèles mutants nuls du facteur de réponse immunitaire Relish ont été générés par CRISPR nhej-médié dans Phlebotomus papatasi4. Des embryons de mouche de sable ont également été injectés dans une autre étude avec un mélange CRISPR/Cas9 ciblant le gène codant jaune. Pourtant, aucun adulte portant la mutation n’a étéproduit 18. Nous décrivons ici une méthode détaillée de mutagenèse ciblée par CRISPR/Cas9, 24 h/24, avec un accent particulier sur la microinjection embryonnaire, une étape critique du protocole.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nous présentons ici une méthode de microinjection embryonnaire récemment développée pour la mutagenèse ciblée par CRISPR/Cas9 chez les mouches de sable phlebotomus papatasi. La microinjection embryonnaire pour la modification génétique des insectes a été développée à Drosophila au milieu des années 198021 et est maintenant couramment utilisée chez une grande variété d’insectes. D’autres méthodes de livraison de matériel de modification génétique ont ét?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs remercient Vanessa Meldener-Harrell pour la lecture critique du manuscrit.
Materials
| Black Filter Paper 4.25CM PK100 | VWR | 28342-012 | Cut into rectangles that are approximately 46 X 22mm. These are placed between the slide and the coverslip and act as a moist base layer for the embryos during injection. |
| Coverslips | Fisher Scientific | 12-543A | |
| Dissecting Microscope | Any brand | For aligning embryos | |
| Glass slides | Fisher Scientific | 12-550-A3 | Base layer of the microinjection set up Figure 2A |
| Insect cage | custom made or several commercial options | polycarbonate cage for adults holding and mating Lawyer, Phillip, Mireille Killick-Kendrick, Tobin Rowland, Edgar Rowton, and Petr Volf. “Laboratory Colonization and Mass Rearing of Phlebotomine Sand Flies (Diptera, Psychodidae).” Parasite 24. Accessed August 6, 2020. https://doi.org/10.1051/parasite/2017041. | |
| Larval food | custom made | a mix of rabbit chow and rabbit feces Lawyer, Phillip, Mireille Killick-Kendrick, Tobin Rowland, Edgar Rowton, and Petr Volf. “Laboratory Colonization and Mass Rearing of Phlebotomine Sand Flies (Diptera, Psychodidae).” Parasite 24. https://doi.org/10.1051/parasite/2017041. | |
| Microcaps 100 ml | Drummond | 1-000-1000 | Used to back fill microinjection needles |
| Mouth aspirator | John W. Hock Company | Model 612 | mouth aspirator with HEPA filter |
| Olympus SZX12 | Olympus Life Sciences | Microinjection microscope | |
| Ovipots | Nalge company | ovipots are made from 125-ml or 500-ml straigh-sided plolypropylene jars modified by drilling 2.5cm holes in the bottom and filled with 1cm of plaster of Paris. Lawyer, Phillip, Mireille Killick-Kendrick, Tobin Rowland, Edgar Rowton, and Petr Volf. “Laboratory Colonization and Mass Rearing of Phlebotomine Sand Flies (Diptera, Psychodidae).” Parasite 24. Accessed August 6, 2020. https://doi.org/10.1051/parasite/2017041. | |
| Paint Brush 6-0 | Any Art Supply Company | n/a | Used for aligning embryos |
| Propionic acid | Sigma-Aldrich | 402907 | antifungal agent |
| Standard Glass Capillaries | World Precision Instruments | 1B100-3 | Used for making microinjection needles |
| Trio-MPC100 Controller and MP845 Manipulator | Sutter Instruments | Microinjection Controller and Micromanipulator |
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