생체 내 이미징은 건강 및 질병 생물학 연구를위한 강력한 도구입니다. 이 프로토콜은 표준 2 광자 현미경으로 마우스 망막의 경공 영상을 설명합니다. 또한 망막의 여러 세포 코호트를 형광으로 표지하는 다양한 생체 내 이미징 방법을 보여줍니다.
망막은 환경의 빛 신호를 뇌로 전파되는 전기 신호로 변환합니다. 망막의 질병은 널리 퍼져 있으며 시각 장애와 실명을 유발합니다. 그러한 질병이 어떻게 진행되는지 이해하는 것은 새로운 치료법을 공식화하는 데 중요합니다. 질병의 동물 모델에서 생체 내 현미경은 신경 퇴행을 이해하는 강력한 도구이며 알츠하이머 병에서 뇌졸중에 이르는 상태의 치료를 향한 중요한 진전을 가져 왔습니다. 망막이 광학 접근법에 의해 본질적으로 접근 할 수있는 유일한 중추 신경계 구조라는 점을 감안할 때, 그것은 자연스럽게 생체 내 영상에 적합합니다. 그러나 수정체와 각막의 기본 광학은 효과적인 이미징 접근에 몇 가지 문제를 제시합니다.
이 프로토콜은 급성 및 만성 기간 이미징 실험 모두에 적용할 수 있는 세포 분해능에서 마우스 망막의 세포 코호트 및 구조의 생체 내 2광자 이미징 방법을 설명합니다. 망막 신경절 세포(RGC), 무축삭 세포, 소교세포 및 아데노 관련 바이러스(AAV) 벡터, 형질전환 마우스 및 무기 염료를 포함한 일련의 라벨링 기술을 사용한 혈관 이미징의 예를 제시합니다. 중요하게는, 이들 기술은 망막의 모든 세포 유형으로 확장되고, 관심있는 다른 세포 집단에 접근하기 위한 제안된 방법이 설명된다. 또한 디스플레이 및 정량화를 위한 수동 이미지 후처리를 위한 예제 전략도 자세히 설명되어 있습니다. 이러한 기술은 건강 및 질병의 망막 기능 연구에 직접 적용 할 수 있습니다.
중추 신경계의 생체 내 시각화에는 일반적으로 두개골 얇아짐 및 유리창 또는 광학 릴레이 렌즈 설치와 같은 침습적 절차가 필요합니다. 망막은 기본적으로 환경으로부터 빛을 받기 때문에 침습적 준비 없이 직접 관찰할 수 있는 신경계의 유일한 구조입니다. 망막에 대한 광학 접근의 용이성은 중추 신경계를 연구하기위한 매력적인 모델 시스템입니다.
생쥐의 망막에 대한 라이브 형광 영상은 녹내장 1,2, 시신경 손상 1,3,4 및 뇌졸중5의 모델에서 RGC 사망뿐만 아니라 퇴행성 조건에서 소교 세포 활성화 6,7,8 및 혈관 구조 9의 변화를 추적하는 데 사용되었습니다. 내재적 신호는 또한 광수용체(10,11,12) 및 망막 색소 상피 세포(13)를 시각화하는데 사용될 수 있다. 망막의 생체 내 영상에 대한 많은 접근법은 안과 목적을 위해 특별히 설계된 고도로 전문화된 장치6 또는 각막 및 수정체 8,9,11,12,13,14의 기본 수차를 교정하기 위해 고도로 수정된 광학 시스템을 사용합니다.
본 프로토콜은 마우스 눈의 전방 광학을 부분적으로 보정하는 기본 방법을 활용하여 세포 분해능에서 망막 내의 형광 신호의 생체내 이미징에 대한 접근 방식을 보여줍니다. 이 전략은 뇌의 생체 내 이미징에 일반적으로 사용되는 다광자 현미경 설정에 대한 아주 작은 적응이 필요합니다. 이 접근 방식은 설정하기 쉽고 마우스는 스트레스가 거의 없기 때문에 급성 및 만성 기간 동안 타임 랩스 실험을 수행하는 데 도움이됩니다. 또한 RGC, 무축삭 세포, 미세아교세포 및 혈관계를 포함한 개별 망막 구성 요소를 표지하는 유전 및 유기 염료 기반 절차는 이 이미징 기술과 호환되며 망막 기능에 중요한 세포 유형 및 구조의 생체 내 관찰을 가능하게 합니다. 이러한 도구는 대부분의 다른 신경 세포 유형과 망막의 신경교 및 혈관 구성 요소를 표시하는 데 적용할 수 있습니다.
본원에 기재된 이광자 영상화 절차는 마우스 망막의 종방향 생체내 영상화를 가능하게 한다. 동일한 망막 영역의 반복 가능한 이미지는 이소플루란 하에서 최대 6시간 이상의 연속적인 기간 동안 획득될 수 있다. 마우스는 동일한 이미징 영역을 찾기 위해 세포 및 혈관 랜드마크를 사용하여 다른 날에 이미징할 수도 있습니다(그림 3). 이러한 목적을 위해 커버 글라스와 결합 된 투명 겔 침지의 사용은 이전에 망막 하 주사를위한 망막의 시각화, 레이저 유도 망막 손상 모델 및 안저 영상20,21,22를 포함한 다양한 절차에 적용되었습니다.
눈의 해부학은 마우스 각막과 렌즈의 높은 광출력이 교정 없이 동공을 통한 직접 이미징을 방해하기 때문에 생체 내 이미징에 고유한 문제를 제시합니다. 몇몇 다른 생체내 영상화 방법은 마우스 눈의 전방 광학의 교정을 위해 평면-오목한 콘택트 렌즈의 사용에 의존한다 7,17,18,19. 각막의 광학 교정만으로 마우스 렌즈의 높은 광학 파워는 불가피한 양의 시차, 특히 주변 스캔 필드의 구조를 초래하여 다른 Z 평면에서 XY 차원의 스트레칭 및 병진 운동으로 나타납니다. X 및 Y 차원에서 이미지 시차 관련 왜곡을 최소화하려면 이미징 영역에서 망막에 대한 접선면이 현미경 광 경로에 수직이 되도록 마우스 눈의 방향을 지정하는 것이 중요합니다. 여기에 설명된 설정은 이 정렬을 달성하기 위해 눈의 각도를 정밀하게 조작하는 데 도움이 됩니다. 두 축을 따라 회전할 수 있는 조정 가능한 마우스 헤드 홀더를 사용하면 실험자가 시차를 최소화하기 위해 Z 차원을 스크롤할 때 눈의 각도를 쉽게 수동으로 조정할 수 있습니다. 이 기울기는 또한 망막의 더 넓은 영역을 이미징 할 수 있도록 동공의 필드 정지 효과를 우회합니다. 헤드 홀더의 구속은 또한 호흡으로 인한 운동 아티팩트를 크게 줄입니다.
연속 이미징 중에 불투명화로 인해 이미지 품질이 저하되므로 마우스 눈의 선명도를 유지하기 위해 주의해야 합니다. 이미징 중에 윤활제 젤을 자주 다시 바르고 각 이미징 세션 후에 연고를 바르면 눈이 건조해지고 혼탁이 발생하는 것을 방지하는 데 도움이 됩니다. 일부 각막 혼탁은 24-48 시간 후에 자발적으로 해결됩니다. 이 프로토콜에 기술된 바와 같이 투명 젤 및 커버 글라스의 사용은 콘택트 렌즈(7)와 유사한 이미지 품질 및 수차 보정을 제공하는 한편, 커버 글라스를 재정렬할 필요 없이 눈 각도의 보다 용이한 조정을 허용한다. 또한 젤은 눈에 지속적인 수분 공급을 제공하여 최대 몇 시간의 급성 영상 세션을 수행 할 수 있습니다. 마지막으로, 커버 글라스가 각막에 접촉하지 않기 때문에, 반복적인 이미징 세션에 대한 광학적 선명도를 감소시킬 수 있는 눈에 대한 자극을 최소화한다.
이 접근법의 한계는 광학 수차가 완전히 보정되지 않는다는 사실입니다. 이것은 무거운 시차로 인해 축 방향 분해능을 심각하게 감소시키는 반면, 소마의 정량적 측정은 단일 이미지 평면에서 얻을 수 있습니다. 망막 뉴런의 형광 신호 강도는 이 방법을 사용한 샘플 정렬에 따라 달라지기 때문에 여기 및 방출 비율 기반 센서는 다양한 이미징 세션에서 샘플을 만성적으로 비교하는 실험에 더 적합합니다. 시스템 수준에서 광학 수차를 교정하는 접근법은 망막 8,9,14,21에서 세포 하 해상도를 허용하는 적응 광학입니다. 그러나 적응형 광학을 구현하려면 고도로 전문화된 장비와 광범위한 전문 지식이 필요합니다.
생체 내 망막 영상에 대한 2 광자 접근법은 컨 포칼 현미경 또는 검안경6이다. 여기에 제시된 접근 방식은 광시야 또는 컨포칼 현미경으로 쉽게 변환할 수 있어야 합니다. 단일 광자 이미징은 아마도 더 견고하고 눈의 각막과 렌즈를 통해 효율적인 2 광자 효과를 달성하는 데 필요한 2 광자 레이저의 높은 에너지로 인해 망막 손상 위험이 적습니다. 2광자 레이저 손상을 방지하려면 이미징 실험 완료 후 전체 망막을 검사하고 이미징된 층의 세포 유형에 대한 면역 염색을 통해 최대 레이저 출력에 대한 임계값을 경험적으로 결정해야 합니다. 여기에 제시된 시스템에서 RGC는 pan-RGC 마커 인 Rbpms로 레이블이 지정되었으며 밀도는 최대 45mW 이미징 전력까지 정상인 반면 55mW는 RGC의 상당한 손실을 초래했습니다 (표시되지 않음).
단일-광자 영상화의 단점은 이러한 접근법이 이광자 영상(23)에 비해 망막의 고유 시각 회로를 매우 심하게 자극할 것이라는 사실이다. 망막 전체 마운트 또는 아이컵 준비를 사용한 이전 실험은 2광자 레이저 스캐닝이 대체로 일시적인 회로 활성화를 유도한다는 것을 보여주었습니다24. 여기에서 Ca 2+ 센서 Twitch2b를 사용한 RGC 활동의 이미징은 레이저 스캐닝의 시작이 대부분의 RGC에서 5-20초 동안 기준선으로 돌아가는 Ca2+ 상승을 유도한다는 것을 보여줍니다(그림 8). 이 프로토콜에서의 레이저 파워가 생체내 망막 광 반응(8)을 보고하는 이전 실험의 범위 내에 있다는 것을 감안할 때, 현재 기술된 방법은 망막에서의 회로 활성의 기록에 복종할 가능성이 높다. 이러한 고려 사항은 회로 활동의 영향을 받을 수 있는 실험에 중요합니다.
이 프로토콜은 두 가지 유형의 망막 뉴런, RGC와 무축삭 세포의 생체 내 이미징을 보여줍니다. 수평 세포 (Cx57-Cre 25), 양극성 세포 (Chx10-Cre 26; mGluR6-GFP 27), 원뿔 광 수용체 (S- 또는 M-옵신 -Cre 28), 막대 광 수용체 (Nrl-Cre 29), 뮐러 아교 세포 (Foxg1-Cre 26) 및 혈관 주위 세포 (NG2-DsRed9)를 포함한 다른 주요 세포 유형의 유사한 표지가 달성 될 수 있습니다. 트랜스제닉 마우스는 또한 RGC의 개별 서브세트를 표지하는데 이용가능하다 (예를 들어, αRGCs30에 대한 KCNG4-Cre; OPN4-Cre for ipRGCs31; J-RGCs 32) 및 무축삭 세포 (예를 들어, 성화상 무축삭 세포26에 대한 ChAT-Cre 및 다양한 무축삭 세포 아형에 대한 신경펩티드 프로모터 드라이버 3,34). 바이러스 벡터는 트랜스제닉 마우스 대신 특정 세포 집단을 표적으로 하는 데 사용할 수 있습니다. 유비쿼터스 CAG 프로모터 요소를 갖는 AAV2의 유리체내 주사는 거의 독점적으로 RGC, 무축삭 세포 및 수평 세포25를 표지한다. 변형된 AAV2.7m8-Y444F 캡시드를 조작된 mGluR6 프로모터 구축물과 페어링하는 것은 ON 양극성 세포(35)의 광범위한 표지를 허용한다. AAV의 망막 하 주사는 광 수용체의 농축을 유도하며, 혈청 형 AAV2 / 5는 가장 높은 형질 도입 효율을 갖는다36. 변형된 AAV6 캡시드 단백질인 Shh10은 신경교 섬유소 산성 단백질 프로모터 요소와 짝을 이루어 Müller glia37에 특이적으로 입증되었습니다.
완전히 비 침습적 인 접근법으로 중추 신경계의 세포를 관찰하는 능력은 신경 회로8의 기본 특성과 신경 퇴행 3,4,5,6,38의 메커니즘을 연구하는 데 사용될 수 있습니다. 많은 맹목 질환은 망막의 세포 집단을 표적으로 하며, 마우스의 생체 내 영상 접근법은 시신경 손상 1,3,4, 황반 변성13, 뇌졸중5, 녹내장 2,6 및 포도막염 7을 연구하는 데 사용되었습니다. 또한, 많은 중추 신경계 신경 퇴행성 상태가 알츠하이머 병39, 다발성 경화증40 및 파킨슨 병41을 포함하여 망막에서 나타납니다. 따라서, 망막의 생체내 영상화를 위해 쉽게 접근할 수 있는 이 기술은 광범위한 신경퇴행성 상태를 연구하기 위한 도구로서 적용될 수 있다.
The authors have nothing to disclose.
이 연구는 실명 예방 연구 재단 (PRW에 대한 경력 개발 상 및 세인트 루이스의 워싱턴 대학교 의과 대학 안과 및 시각 과학과에 대한 무제한 보조금), 국립 DrDeramus Research (BrightFocus Foundation의 프로그램) 및 McDonnell Center for Cellular and Molecular Neurobiology의 보조금으로 지원되었습니다. Z.W.는 기관 국립 연구 서비스 상 T32 EY013360의 지원을 받습니다. 이 연구는 또한 워싱턴 대학교 의과 대학의 희망 센터 바이러스 벡터 코어의 지원을 받았습니다.
#1.5 coverslip | ThermoFisher | 152440 | Richard-Allan #1.5 24 mm x 40 mm |
50 mL glass syringe | Hamilton | 80950 | 22G cemented needle |
Adeno-associated virus (AAV2) | Hope Center Viral Core | NA | |
Anesthesia Air Pump | RWD Life Science | R510-30 | |
Atropine | Sigma | A0132 | For pupil dilator solution |
Basic Small Animal Anesthesia Device | RWD Life Science | R500IE | |
Borosilicate glass capillary | Sutter | B150-86-10 | Outside diameter 1.50 mm, inside diameter 0.86 mm, length 10 cm |
CFP/YFP filter cube | Chroma | custom | 480/40, 505 long pass, 535/30 |
ChromoFlex – Two channel PMT detection unit | Scientifica | S-MPLG-1002 | |
Circulating heating pump | Braintree Scientific | tp-700 | Set to 37 °C |
Cling film | VWR | 10713-916 | |
Compact Filter Holder | ThorLabs | DH1 | Holds coverslip over mouse eye |
Cx3cr1-GFP transgenic mice (B6.129P2(Cg)-Cx3cr1tm1Litt/J) | The Jackson Laboratory | 005582 | |
DAQ controller chassis | National Instruments | PXIe-1073 | |
Data acquisition device | National Instruments | BNC-2090A | |
Evans Blue dye | Fisher Scientific | AAA1677409 | |
FPGA module with digitizer | National Instruments | NI-5734 | |
Gas Evacuation Apparatus | RWD Life Science | R546W | |
GenTeal Severe lubricant eye gel | Alcon | (from local pharmacy) | For use during imaging |
GFP/Red filter cube | Chroma | custom | 535/30, 560 long pass, 605/70 |
Heating pad | McKesson Medical and Surgical | 190147 | |
HyperScope Launch Optics for use with Pockels Cell | Scientifica | S-MP-101080 | |
HyperScope Main module | Scientifica | S-MP-100466 | |
HyperScope Scan Path | Scientifica | S-MP-100406 | |
HyperScope X galvo Module | Scientifica | MP-100443 | |
ImageJ Fiji software | Freeware | ||
Isoflurane | Patterson Veterinary | NDC 14043-704-06 | |
Isoflurane gas filter cannister (active scavenging) | RWD Life Science | R510-31 | |
Isoflurane gas filter cannister (passive scavenging) | RWD Life Science | R510-31S | |
ketamine HCl (100 mg/mL) | Vedco | NDC 50989-161-06 | |
M32 to M26 adapter | ThorLabs | M32M26S | |
MaiTai GUI software | Spectra-Physics | NA | |
MATLAB software | MathWorks | NA | R2015b |
meloxicam (5 mg/mL) | Boehringer Ingelheim | NDC 0010-6013-01 | Analgesic |
Micorscope Objective | Edmund Optics | 46-404 | Mitutoyo WE715042319 |
micropipette puller | Sutter | Flaming/Brown Model P-97 | |
Mineral oil | Fisher | BP2629-1 | |
Mini bulldog hemostatic clamp | Fine Science Tools | 18053-28 | |
Miniature EVA Tubing 0.02" ID, 0.06" OD | McMaster Carr | 1883T1 | |
Miniature EVA Tubing 0.05" ID, 0.09" OD | McMaster Carr | 1883T4 | |
Mouse head holder | Narishige | SGM-4 | |
No. 5 Forceps | Fine Science Tools | 11251-10 | |
Optic Posts 1/2" | ThorLabs | TR3-P5 | |
Optical power meter kit | ThorLabs | PM100D | |
pE-300 Ultra LLG Deivery | Scientifica | COO-LED3ULLGs | |
Phenylephrine hydrochloride | Sigma | P6126 | For pupil dilator solution |
Pockels cell | Conoptics | 350-80-02 | |
Pockels cell amplifier | Conoptics | Model 302RM | |
Proparacaine hydrochloride | Sigma | 1571001 | For eye immobilization |
Red & Far Red short pass filter Cube | Chroma | custom | 560 short pass |
Rotating 1/2" post clamp | ThorLabs | SWC | |
ScanImage package | Vidrio Technologies | Freeware | Image acquisition software; Version 5.4.0 (2018); requires MATLAB |
sodium chloride solution, sterile (0.9%) | Fresenius Kabi | NDC 63323-186-01 | |
Stereomicroscope | Leica | S9 E | |
Tabletop centrifuge | Oxford | Benchmate C8 | |
Terramycin oxytetracycline/polymyxin B antibiotic ophthalmic ointment | Zoetisus | NA | For use after intravitreal injection |
ThermoRack cooling system | Solid State Cooling Systems | ThermoRack 401 | Set to 20 °C |
Ultrafast Ti:Sapphire laser | Spectra-Physics | Mai Tai DeepSee | |
Vgat-Cre transgenic mice (Slc32a1tm2(cre)Lowl/J) | The Jackson Laboratory | 016962 | |
VGlut2-Cre transgenic mice (Slc17a6tm2(cre)Lowl/J) | The Jackson Laboratory | 016963 | |
VivoScope for In Vivo Imaging | Scientifica | S-MPVS-1200-00P | |
White petrolatum-mineral oil lubricant eye ointment | Stye | NA | For use after imaging |
xylazine HCl (20 mg/mL) | Akorn | NDC 59399-110-20 |