El aparato anulador del sueño: un método altamente eficiente de privación del sueño a Drosophila
Summary
La privación del sueño es una herramienta poderosa para investigar la función y regulación del sueño. Describimos un protocolo para privar del sueño a Drosophila utilizando el Aparato Anulador del Sueño, y para determinar el alcance del sueño de rebote inducido por la privación.
Abstract
La homeostasis del sueño, el aumento del sueño observado después de la pérdida de sueño, es uno de los criterios definitorios utilizados para identificar el sueño en todo el reino animal. Como consecuencia, la privación del sueño y la restricción del sueño son herramientas poderosas que se utilizan comúnmente para proporcionar información sobre la función del sueño. Sin embargo, los experimentos de privación del sueño son inherentemente problemáticos en el momento en que el estímulo de privación en sí mismo puede ser la causa de los cambios observados en la fisiología y el comportamiento. En consecuencia, las técnicas exitosas de privación del sueño deben mantener a los animales despiertos e, idealmente, dar como resultado un rebote robusto del sueño sin inducir también una gran cantidad de consecuencias no deseadas. Aquí, describimos una técnica de privación del sueño para Drosophila melanogaster. El Aparato Anulador del Sueño (SNAP) administra un estímulo cada 10s para inducir geotaxis negativas. Aunque el estímulo es predecible, el SNAP previene eficazmente el sueño >95% de la noche, incluso en moscas con un alto impulso de sueño. Es importante destacar que la respuesta homeostática posterior es muy similar a la lograda mediante la privación de la mano. El tiempo y el espaciamiento de los estímulos se pueden modificar para minimizar la pérdida de sueño y, por lo tanto, examinar los efectos no específicos del estímulo en la fisiología y el comportamiento. El SNAP también se puede utilizar para la restricción del sueño y para evaluar los umbrales de excitación. El SNAP es una poderosa técnica de interrupción del sueño que se puede utilizar para comprender mejor la función del sueño.
Introduction
El sueño es casi universal en los animales, sin embargo, su función sigue sin estar clara. La homeostasis del sueño, el aumento compensatorio del sueño después de la privación del sueño, es una propiedad definitoria del sueño, que se ha utilizado para caracterizar los estados de sueño en un número de animales1,2,3,4,5.
El sueño en la mosca tiene muchas similitudes con el sueño humano, incluida una respuesta homeostática robusta a la pérdida de sueño4,5. Numerosos estudios sobre el sueño en la mosca han utilizado la privación del sueño tanto para inferir la función del sueño al examinar las consecuencias adversas que se derivan de la vigilia prolongada, como para comprender la regulación del sueño mediante la determinación de los mecanismos neurobiológicos que controlan la regulación homeostática del sueño. Así, se demostró que las moscas privadas de sueño exhiben deficiencias en el aprendizaje y la memoria6,7,8,9,10,11, 12,plasticidad estructural13,14,15,atención visual16,recuperación de una lesión neuronal17,18,apareamiento y comportamientos agresivos19, 20, proliferación celular21, y respuestas al estrés oxidativo22,23 por nombrar algunos. Además, las investigaciones sobre los mecanismos neurobiológicos que controlan el sueño de rebote han arrojado información crítica sobre la maquinaria neuronal que constituye el homeostato del sueño8,9,23,24,25,26,27,28,29 . Finalmente, además de revelar información fundamental sobre la función del sueño en animales sanos, los estudios de privación del sueño también han informado sobre la función del sueño en estados enfermos30,31.
Si bien la privación del sueño es innegablemente una herramienta poderosa, con cualquier experimento de privación del sueño, es importante distinguir los fenotipos que resultan de la vigilia prolongada, de los inducidos por el estímulo utilizado para mantener al animal despierto. La privación del sueño por privación de la mano o manejo suave, generalmente se considera que establece el estándar para la privación del sueño mínimamente perturbadora. Aquí describimos un protocolo para privar del sueño a las moscas utilizando el Aparato de Anulación del Sueño (SNAP). El SNAP es un dispositivo que entrega un estímulo mecánico a las moscas cada 10 s, manteniendo a las moscas despiertas mediante la inducción de geotaxis negativas(Figura 1). El SNAP priva eficientemente a las moscas del >98% del sueño nocturno, incluso en moscas con alto nivel de sueño8,32. El SNAP ha sido calibrado en moscas sensibles a la explosión, la agitación de las moscas en el SNAP no daña a las moscas; la privación del sueño con el SNAP induce un rebote comparable al obtenido por la privación de la mano7. El SNAP es, por lo tanto, un método robusto para privar del sueño a las moscas mientras controla los efectos del estímulo excitante.
Protocol
Representative Results
Discussion
El sueño en Drosophila se caracterizó de forma independiente en 2000, por dos grupos4,5. En estos estudios pioneros, las moscas se vieron privadas del sueño por un manejo suave (es decir, privación de la mano) y se demostró que exhiben una respuesta homeostática robusta a la privación del sueño durante la noche. Es importante destacar que con cualquier experimento de privación del sueño es crucial controlar los posibles efectos de confusión de…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por las subvenciones de los NIH 5R01NS051305-14 y 5R01NS076980-08 a PJS.
Materials
| Locomotor activity tubes | |||
| Fisher Tissue Prep Wax | Thermo Fisher | 13404-122 | Wax used for sealing tubes |
| Glass tubes | Wale Apparatus | 244050 | We cut 5mm diameter Pyrex glass tubes into 65mm long tubes to record sleep. Pre-cut tubes can also be purchased. |
| Nutri Fly Bloomington Formulation fly food | Genesee Scientific | 66-113 | Labs might use their own fly food recipe. It is important that sleep be recorded on the same food that flies were reared in. |
| Rotary glass cutting tool | Dremel Multi Pro | 395 | Used to cut 65mm long glass tubes |
| Monitoring Sleep | |||
| DAM System and DAMFileScan software | Trikinetics | Software used to acquire data from DAM monitors and save the acquired data in an appropriate format | |
| Data acquisition computer | Lenovo | Idea Centre AIO3 | A equivalent computer from any manufacturer can substitute |
| Drosophila Activity Monitors | Trikinetics | DAM2 | These monitors are used to record flies' locomotor activity |
| Environment Monitor | Trikinetics | DEnM | Not essential, but an easy way to monitor environmental conditions in the chamber where sleep is recorded |
| Light Controller | Trikinetics | LC4 | A convenient way to control the timing of when the SNAP is turned on and off |
| Power Supply Interface Unit for DAM | Trikinetics | PSIU-9 | Required for data acquisition computers to record Trikinetics locomotor acitvity data |
| RJ11 connector | 7001-64PC | Multicomp | DAM monitors accept RJ11 jacks |
| Splitters | Trikinetics | SPLT5 | Used to connect upto 5 DAM monitors |
| Telephone cable wire | Radioshack | 278-367 | Phone cables to acquire data from DAM monitors |
| Sleep Deprivation | |||
| Power supply | Gw INSTEK | GPS-30300 | Power supply for the SNAP |
| Sleep Nullifying Apparatus | Washington University School of Medicine machine shop |
References
- Nath, R. D., et al. The Jellyfish Cassiopea Exhibits a Sleep-like State. Current Biology. 27 (19), 2984-2990 (2017).
- Vorster, A. P., Krishnan, H. C., Cirelli, C., Lyons, L. C. Characterization of sleep in Aplysia californica. Sleep. 37 (9), 1453-1463 (2014).
- Zhdanova, I. V., Wang, S. Y., Leclair, O. U., Danilova, N. P. Melatonin promotes sleep-like state in zebrafish. Brain Research. 903 (1-2), 263-268 (2001).
- Shaw, P. J., Cirelli, C., Greenspan, R. J., Tononi, G. Correlates of sleep and waking in Drosophila melanogaster. Science. 287 (5459), 1834-1837 (2000).
- Hendricks, J. C., et al. Rest in Drosophila is a sleep-like state. Neuron. 25 (1), 129-138 (2000).
- Ganguly-Fitzgerald, I., Donlea, J., Shaw, P. J. Waking experience affects sleep need in Drosophila. Science. 313 (5794), 1775-1781 (2006).
- Seugnet, L., Suzuki, Y., Vine, L., Gottschalk, L., Shaw, P. J. D1 receptor activation in the mushroom bodies rescues sleep-loss-induced learning impairments in Drosophila. Current Biology. 18 (15), 1110-1117 (2008).
- Donlea, J. M., Thimgan, M. S., Suzuki, Y., Gottschalk, L., Shaw, P. J. Inducing sleep by remote control facilitates memory consolidation in Drosophila. Science. 332 (6037), 1571-1576 (2011).
- Seidner, G., et al. Identification of Neurons with a Privileged Role in Sleep Homeostasis in Drosophila melanogaster. Current Biology. 25 (22), 2928-2938 (2015).
- Li, X., Yu, F., Guo, A. Sleep deprivation specifically impairs short-term olfactory memory in Drosophila. Sleep. 32 (11), 1417-1424 (2009).
- Melnattur, K., et al. A conserved role for sleep in supporting Spatial Learning in Drosophila. Sleep. , 197 (2020).
- Seugnet, L., Suzuki, Y., Donlea, J. M., Gottschalk, L., Shaw, P. J. Sleep deprivation during early-adult development results in long-lasting learning deficits in adult Drosophila. Sleep. 34 (2), 137-146 (2011).
- Donlea, J. M., Ramanan, N., Shaw, P. J. Use-dependent plasticity in clock neurons regulates sleep need in Drosophila. Science. 324 (5923), 105-108 (2009).
- Bushey, D., Tononi, G., Cirelli, C. Sleep and synaptic homeostasis: structural evidence in Drosophila. Science. 332 (6037), 1576-1581 (2011).
- Huang, S., Piao, C., Beuschel, C. B., Götz, T., Sigrist, S. J. Presynaptic Active Zone Plasticity Encodes Sleep Need in Drosophila. Current Biology. 30 (6), 1077-1091 (2020).
- Kirszenblat, L., et al. Sleep regulates visual selective attention in Drosophila. Journal of Experimental Biology. 221, (2018).
- Singh, P., Donlea, J. M. Bidirectional Regulation of Sleep and Synapse Pruning after Neural Injury. Current Biology. 30 (6), 1063-1076 (2020).
- Stanhope, B. A., Jaggard, J. B., Gratton, M., Brown, E. B., Keene, A. C. Sleep Regulates Glial Plasticity and Expression of the Engulfment Receptor Draper Following Neural Injury. Current Biology. 30 (6), 1092-1101 (2020).
- Kayser, M. S., Yue, Z., Sehgal, A. A critical period of sleep for development of courtship circuitry and behavior in Drosophila. Science. 344 (6181), 269-274 (2014).
- Kayser, M. S., Mainwaring, B., Yue, Z., Sehgal, A. Sleep deprivation suppresses aggression in Drosophila. Elife. 4, 07643 (2015).
- Szuperak, M., et al. A sleep state in Drosophila larvae required for neural stem cell proliferation. Elife. 7, (2018).
- Vaccaro, A., et al. Sleep Loss Can Cause Death through Accumulation of Reactive Oxygen Species in the Gut. Cell. 181 (6), 1307-1328 (2020).
- Kempf, A., Song, S. M., Talbot, C. B., Miesenböck, G. A potassium channel β-subunit couples mitochondrial electron transport to sleep. Nature. 568 (7751), 230-234 (2019).
- Donlea, J. M., Pimentel, D., Miesenböck, G. Neuronal machinery of sleep homeostasis in Drosophila. Neuron. 81 (4), 860-872 (2014).
- Liu, S., Liu, Q., Tabuchi, M., Wu, M. N. Sleep Drive Is Encoded by Neural Plastic Changes in a Dedicated Circuit. Cell. 165 (6), 1347-1360 (2016).
- Pimentel, D., et al. Operation of a homeostatic sleep switch. Nature. 536 (7616), 333-337 (2016).
- Sitaraman, D., et al. Propagation of Homeostatic Sleep Signals by Segregated Synaptic Microcircuits of the Drosophila Mushroom Body. Current Biology. 25 (22), 2915-2927 (2015).
- Foltenyi, K., Greenspan, R. J., Newport, J. W. Activation of EGFR and ERK by rhomboid signaling regulates the consolidation and maintenance of sleep in Drosophila. Nature Neuroscience. 10 (9), 1160-1167 (2007).
- Seugnet, L., et al. Notch signaling modulates sleep homeostasis and learning after sleep deprivation in Drosophila. Current Biology. 21 (10), 835-840 (2011).
- Seugnet, L., Galvin, J. E., Suzuki, Y., Gottschalk, L., Shaw, P. J. Persistent short-term memory defects following sleep deprivation in a Drosophila model of Parkinson disease. Sleep. 32 (8), 984-992 (2009).
- Tabuchi, M., et al. Sleep interacts with aβ to modulate intrinsic neuronal excitability. Current Biology. 25 (6), 702-712 (2015).
- Melnattur, K., Zhang, B., Shaw, P. J. Disrupting flight increases sleep and identifies a novel sleep-promoting pathway in Drosophila. Science Advances. 6 (19), 2166 (2020).
- Thimgan, M. S., Suzuki, Y., Seugnet, L., Gottschalk, L., Shaw, P. J. The perilipin homologue, lipid storage droplet 2, regulates sleep homeostasis and prevents learning impairments following sleep loss. PLOS Biology. 8 (8), (2010).
- Keene, A. C., et al. Clock and cycle limit starvation-induced sleep loss in Drosophila. Current Biology. 20 (13), 1209-1215 (2010).
- Shaw, P. J., Tononi, G., Greenspan, R. J., Robinson, D. F. Stress response genes protect against lethal effects of sleep deprivation in Drosophila. Nature. 417 (6886), 287-291 (2002).
- Andretic, R., Shaw, P. J. Essentials of sleep recordings in Drosophila: moving beyond sleep time. Methods Enzymol. 393, 759-772 (2005).
- Seugnet, L., et al. Identifying sleep regulatory genes using a Drosophila model of insomnia. Journal of Neuroscience. 29 (22), 7148-7157 (2009).
- Bushey, D., Huber, R., Tononi, G., Cirelli, C. Drosophila Hyperkinetic mutants have reduced sleep and impaired memory. Journal of Neuroscience. 27 (20), 5384-5393 (2007).
- Geissmann, Q., et al. Ethoscopes: An open platform for high-throughput ethomics. PLOS Biology. 15 (10), 2003026 (2017).
- Faville, R., Kottler, B., Goodhill, G. J., Shaw, P. J., van Swinderen, B. How deeply does your mutant sleep? Probing arousal to better understand sleep defects in Drosophila. Scientific Reports. 5, 8454 (2015).
- Huber, R., et al. Sleep homeostasis in Drosophila melanogaster. Sleep. 27 (4), 628-639 (2004).
- Klose, M., Shaw, P. Sleep-drive reprograms clock neuronal identity through CREB-binding protein induced PDFR expression. bioRxiv. , (2019).
- Dissel, S., et al. Sleep restores behavioral plasticity to Drosophila mutants. Current Biology. 25 (10), 1270-1281 (2015).
- Gerstner, J. R., Vanderheyden, W. M., Shaw, P. J., Landry, C. F., Yin, J. C. Fatty-acid binding proteins modulate sleep and enhance long-term memory consolidation in Drosophila. PLoS One. 6 (1), 15890 (2011).
