이 프로토콜의 목표는 장기 문화를 위한 접근가능하고 간단한 기술을 사용하여 혈관화된 인간 피부 등가물의 생성 및 체적 분석을 설명하는 것입니다. 가능한 한, 단계에 대한 근거는 연구원이 연구 요구에 따라 사용자 정의 할 수있는 능력을 허용하기 위해 설명된다.
인간 피부 등가물(HSEs)은 인간의 피부의 표피 및 진피 성분을 모델링하는 조직 설계 구조입니다. 이 모형은 피부 발달, 상처 치유 및 접목 기술을 연구하기 위하여 이용되었습니다. 많은 HsEs는 혈관이 계속 부족하고 구조의 체적 평가를 제한하는 포스트 배양 조직학적 단면을 통해 추가로 분석됩니다. 여기에 제출 혈관 인체 피부 등가물을 생성하기 위해 접근 가능한 재료를 활용하는 간단한 프로토콜 (VHSE); 또한 설명된 것은 이러한 구조의 체적 이미징 및 정량화 기술이다. 간단히, VHSEs는 진피 및 표피 세포가 쥐 꼬리 콜라겐 타입 I 젤로 종향되는 12개의 잘 배양 인서트에서 생성됩니다. 진피 구획은 콜라겐 젤 전체에 분산된 섬유아세포 및 내피 세포로 구성됩니다. 표피 구획은 공기 액체 인터페이스에서 분화하는 각질 세포 (피부 상피 세포)로 구성됩니다. 중요 한 것은, 이러한 방법은 연구원의 요구에 따라 사용자 정의, 두 개의 다른 섬유 아 세포 유형VHSE 세대를 보여주는 결과: 인간 진 피 섬유 아 세포 (hDF) 그리고 인간의 폐 섬유 아 세포 (IMR90s). VHS는 공초점 현미경 검사를 통해 개발되었으며, 4주 및 8주 시점에서 계산 소프트웨어를 사용하여 볼륨으로 분석되었습니다. 볼륨 검사를 위한 수정, 얼룩, 이미지 및 명확한 VHS를 위한 최적화된 프로세스가 설명되어 있습니다. 이 포괄적인 모델, 이미징 및 분석 기술은 이전 HSE 경험이 있거나 없는 개별 실험실의 특정 연구 요구에 쉽게 사용자 정의할 수 있습니다.
인간의 피부는 면역/기계적 장벽으로 작용하고, 체온을 조절하며, 물 보존 및 감각 역할에 참여하는 등 많은 필수 생물학적 기능을 수행한다1,2,3,4. 해부학적으로, 피부는 인체에서 가장 큰 기관이며 3 개의 주요 층 (표피, 진피 및 피하)으로 구성되어 있으며 표피 세포 외에도 기질, 혈관, 선 및 면역 / 신경계 구성 요소의 복잡한 시스템을 가지고 있습니다. 표피 자체는 기본 피부의 장벽 기능 및 기타 구조(즉, 땀과 피지선,손톱)를유지하기 위해 지속적으로 갱신되는 4층의 세포로 구성된다. 피부 생리학은 면역 기능, 상처 치유, 암 생물학 및 기타 분야에서 중요하며, 연구자는 체외 단문화에서 생체 내 동물 모델에 이르기까지 광범위한 모델을 사용하는 데 중요합니다. 동물 모델은 피부 생리학의 전체 복잡성을 연구하는 기능을 제공하지만, 마우스와 같은 일반적으로 사용되는 동물 모델은 인간에 비해 상당한 생리적 차이가5. 이러한 제한, 그리고 동물 모델의 증가 비용, 더 밀접 하 게 인간의 피부의 생리를 반영 하는 체 외 모델 개발에 초점을 많은 연구원을 주도했다1,6. 이들 중, 간단한 모델 유형 중 하나는 세포형 진피 매트릭스에 표피 각질 세포만으로 구성된 인간 표피 등가(HEE; 반두께 피부 모델라고도 함)이지만 생체내에서 볼 수 있는 표피 분화 및 계층화를 포착한다. 이를 바탕으로 진피 및 표피 성분(각질 세포 및 섬유아세포)을 포함하는 모델은 종종 인간 피부 등가물(HSE), 전체 두께 피부 모델 또는 조직형 피부 구조(OSC)라고 합니다. 간략하게, 이 모형은 겔 행렬 내의 진피 세포를 캡슐화하고 위에 표피 세포를 파종하여 생성됩니다. 표피 분화 및 계층화는 전문 매체 및 공기 노출7을통해 달성될 수 있다. 피부 등가물은 콜라겐 타입 I(쥐 꼬리 또는 소 피부 원점 중하나)로만든 진피 젤을 사용하여 자체 조립 기술을 통해 가장 자주 발생하였지만, 유사한 모델은피브린9,10과같은 다른 매트릭스 성분을 통합했다. 섬유아세포 유래11,12,cadaveric 탈표형 멤브레인13,14,15,16,시판 가능한 젤 및 기타1,12,13,17,18,19. 현재, 시판되는 피부 등가물(이전에 검토된1,2)이있다. 그러나, 이들은 주로 치료 목적을 위해 개발 하 고 특정 연구 질문에 쉽게 사용자 지정 할 수 없습니다.
HsEs는 상처 치유, 접목, 독성학 및 피부질환/발달11,12,13,16,8,20,21,22,23등의연구에 적용되었다. 3D 배양은 2D배양(24)에비해 인간 조직의 기능을 보다 포괄적으로 모델로 하지만, 생체 내 인구를 보다 정확하게 반영하는 다양한 세포 유형을 포함하면 복잡한조직(24,25,26)에서세포-세포 조정에 대한 연구가 가능하게 됩니다. 대부분의 HSEs는 생체 내 피부 환경이 다른 많은 세포 유형을 포함하지만, 대부분의 HSEs는 진피 섬유아세포와 표피 각질 세포27을포함한다. 최근 연구는 더 많은 세포 인구를 포함 하 여 시작 했습니다.; 이들 로는 혈관 내분비세포(10,28,29,30,31,32,33,34, 34)및 하복부 구형 조직에서의 분피세포(35,36,신경성분19)를 포함한다.,21,줄기세포27,37,38,면역세포10,39,40,41, 42,기타 질병/암특이모델(16,40,43,44,45,46, 46,47)및 기타 질환/암 특이적 모델. 이들 중 특히 중요 한 혈관; 일부 HsEs는 혈관 세포를 포함하지만, 전반적으로 그들은 여전히 전체 진피 에 걸쳐 연결포괄적 인 모세관 요소가 부족10,29, 시험관 내 안정성(28)및 적절한 혈관 밀도 확장. 또한, HSE 모델은 일반적으로 HSE의 3차원 구조의 분석을 제한하는 배양 후 조직학적 단면을 통해 평가된다. 3차원 분석을 통해 혈관밀도(48,49)의 체적 평가뿐만 아니라 표피 두께 및 분화의 지역적 변화를 가능하게 한다.
HsE는 가장 일반적인 organotypic 모델 중 하나이지만 적절한 세포 외 매트릭스 및 세포 밀도, 미디어 레시피, 적절한 공기 액체 인터페이스 절차 및 배양 후 분석을 포함하여 이러한 구조를 생성하는 데 많은 기술적 인 문제가 있습니다. 또한 HEE 및 HSE 모델은 프로토콜을 발표했지만, 조직학적 분석보다는 진피 혈관 및 체적 이미징을 통합한 상세한 프로토콜은 존재하지 않는다. 이 작품은 주로 상업적세포주로부터 혈관화된 인간 피부 등가물(VHSE)의 배양에 접근할 수 있는 프로토콜을 제시한다. 이 프로토콜은 쉽게 사용자 정의 할 수 있도록 작성, 다른 세포 유형과 연구 요구에 직선 적응을 허용. 접근성, 가용성 및 비용을 위해 간단한 제품 및 생성 기술의 사용은 시판되는 제품을 사용하는 데 우선순위를 두였습니다. 또한, VHSE의 3차원 구조의 평가를 허용하는 간단한 체적 이미징 및 정량화 방법이 설명된다. 이 절차를 강력하고 접근 가능한 프로토콜로 변환하면 비 전문 연구자들은 개인화 된 의학, 혈관 조직 공학, 이식 개발 및 약물 평가에 이러한 중요한 모델을 적용 할 수 있습니다.
이 프로토콜은 VHSEs 생성및 3차원 분석을 위한 간단하고 반복가능한 방법을 보여 주었습니다. 중요한 것은 이 방법은 몇 가지 특수 기술이나 장비 조각에 의존하여 다양한 실험실에 액세스할 수 있도록 합니다. 또한, 세포 모형은 프로토콜에 있는 제한적인 변경으로 대체될 수 있습니다, 연구원이 그들의 특정 필요에 이 프로토콜을 적응할 수 있도록.
적절한 콜라겐 겔화는 피부 문화를 확립하는 데 있어 어려운 단계입니다. 특히 정제 없이 원유 제제를 사용할 때, 미량 오염물질은 겔화 과정에 영향을 미칠 수 있습니다. 일관성을 보장하기 위해 VHSE 생성에 사용되는 동일한 콜라겐 스톡으로 실험 그룹을 수행해야 합니다. 또한, 겔화는 이상적으로 7-7.4의 pH에서 발생해야 하며, 미량 오염물질은 pH를 이동할 수 있다. 콜라겐 스톡을 사용하기 전에, 연습 세포 젤은 원하는 농도에서 만들어져야하며 pH는 겔화 전에 측정되어야한다. 진피 성분 파종을 시작하기 전에 이 콜라겐 품질 검사를 완료하면 완전한 실험을 시작하기 전에 적절한 겔화 및 콜라겐 균질성에 대한 문제를 식별합니다. 세포세포 콜라겐을 배양 삽입에 직접 파종하는 대신, 일부 콜라겐을 pH 스케일 전체를 평가하고 7-7.4의 pH를 확인하는 pH 스트립에 시드합니다. 겔화는 콜라겐 젤 용액의 액적액을 커버슬립 또는 조직 배양 플라스틱 웰 플레이트에 적용하여 평가될 수 있다(양문화 인서트가 제한된 측면을 시뮬레이션하는 것이 좋습니다). 겔화 시간 후에, 콜라겐은 단단해야 한다, 즉, 접시가 기울어질 때 흐어서서는 안 된다. 상 대비 현미경 검사에서 콜라겐은 균일하고 명확해 보일 것입니다. 콜라겐 파종에서 가끔 거품은 정상이지만 명확한 젤 내에서 불투명 콜라겐의 큰 비정질 방울은 혼합이 부족하여 문제가 발생할 수 있음을 나타냅니다, 잘못된 pH, 및 /또는 혼합 하는 동안 냉각 콜라겐을 유지 하지 못하는.
세포 시싱 양 및 매체가 조절될 수 있다. 상기 프로토콜에서 캡슐화된 세포 양은 진피 구조 위에 시드된 콜라겐의 mL당 7.5 x 104 섬유아세포 및 7.5 x 105 내피세포에서 12웰 삽입에 최적화되었다. 세포 밀도는 다양한 콜라겐 농도48 및 HSE 세대22,80,81에서3D 혈관 네트워크 생성을 조사하는 예비 연구 및 이전 연구를 기반으로 이러한 VHSE프로토콜에최적화되었습니다. 유사한 시스템에서, 발표된 내피 세포 밀도는 1.0 x 106 세포/mL 콜라겐48; 섬유아세포 농도는 콜라겐 22, 28, 82 ~ 1 x 10 5 세포/mL의 콜라겐22,22, 28,1 x 10 5 세포/mL의 0.4 x 105 세포/mL로부터 의 범위 8,58,83,84,85; 및 각질 세포 농도는 0.5 x 105 [세포/cm 2]80 ~ 1 x 105 [세포/cm2]8범위이다. 세포 밀도는 특정 세포 및 연구 질문에 최적화될 수 있습니다. 섬유아세포와 같은 수축세포를 가진 3차원 배양은 생존력 감소 및 배양손실(86,87)으로이어지는 계약을 체결할 수 있다. 예비 실험은 진피 구획의 수축을 테스트하기 위해 완료되어야합니다 (더 많은 진피 세포, 더 수축 성 진피 세포, 더 긴 침수 배양 또는 부드러운 행렬로 발생할 수 있음) 표피 표면 커버리지를 테스트합니다. 또한, 침수일 수 및 세럼 함량을 가감하는 속도또한 과도한 진피 수축이 발생하거나 각질 세포 커버리지의 다른 비율이 필요한 경우 사용자 정의 할 수 있습니다. 예를 들어, 진피 침수 기간 동안 수축이 발견되거나 각질 세포가 표면 단층을 설정하는 동안 혈청 테이퍼링 공정을 통해 더 빠르게 이동하고 VHS를 ALI로 올리는 것은 추가 수축을 방지하는 데 도움이 될 수 있다. 마찬가지로, 각질 세포 적용범위가 이상적이지 않다면, 혈청 없이 VHSE가 침수되는 일수를 변경하면 표피 단층 커버리지를 증가시키고 혈청이 제외되기 때문에 수축을 완화하는 데 도움이 될 수 있다. 위의 세포 밀도 또는 기타 제안의 변화는 특정 배양 및 연구 목표에 최적화되어야 합니다.
공기 액체 인터페이스(ALI) 기간 동안 표피의 적절한 계층화를 확립하기 위해 각 우물의 유체 수준을 정기적으로 확인하고 유지하여 각 구조의 ALI 및 적절한 수분 공급이 배양 길이 전반에 걸쳐 유지되도록 하는 것이 중요합니다. 일관된 ALI 수준이 설정될 때까지 미디어 수준을 매일 확인하고 추적해야 합니다. 표피 층은 건조하지 않고 수분을 유지해야 하지만 구성에 미디어 풀이 없어야 합니다. ALI 동안, 구조는 정상 불투명 한 흰색 / 노란색 색상을 개발할 것입니다. 표피 층은 고르지 않게 개발할 것입니다. 일반적으로, VHSEs는 콜라겐 파종 또는 진피 수축으로 인해 기울어져 있습니다. 또한 12웰 크기로 VHSE의 둘레 주변의 더 작은 구문(24웰 크기)과 능선 형성으로 구문 중간에 더 높은 표피 부분을 관찰하는 것이 정상이다. 구문(13)의 수축은 이러한 지형 형성을 변화시킬 수 있으며, 전혀 관찰되지 않을 수 있다.
VHS의 염색 및 이미징은 VHS에 기계적 조작을 도입합니다. 각 문화의 조작을 계획하고 제한하는 것이 매우 중요합니다. 조작이 필요한 경우 삽입 막에서 VHS를 제거할 때, 구조 표면에 염색 또는 세척 솔루션을 추가할 때, 이미징 준비 중에 저장/이미징 우물에서 VHSEs를 제거하고 교체할 때 부드러운 움직임을 유지합니다. 구체적으로, 표피 성분의 정맥 층은 깨지기 쉬우며 기저 표피 층을 벗겨낼 위험이 있다. 표피의 표피 층은 고약하고 토착 조직4에서도담수를 거치지만 표피 구조의 정확한 분석을 위해 손상이나 손실을 최소화하는 것이 중요합니다. 표피 레이어가 구문에서 들어 올리면 별도로 이미지를 지정할 수 있습니다. 표피의 기저층은 여전히 진피에 부착되어 있으며, apical 층의 일부가 분리될 수 있습니다. 표피의 시각화를 위해, 핵 얼룩은 조밀한 핵이 표피의 하부 및 중간 층의 특성이기 때문에 이를 관찰하는 데 도움이됩니다.
VHSE 후 고착의 공초점 화상 진찰은 프로토콜에서 논의되고 있으나, 직립 기반 광학 일관성 단층 촬영(OCT)88,89,90,91,92, 93을통해 배양 전반에 걸쳐 VHSEs를 이미지화할 수도 있다. VHSE는 눈에 띄는 효과 없이 적어도 2 시간 동안 잠복또는 가습 없이 화상 진찰을 견딜 수 있을 만큼 안정적입니다. OCT는 라벨이 없고 비침습적이기 때문에 성숙 시 표피 두께를 추적할 수 있습니다. 그밖 비침범적인 화상 진찰 양식은 가능성이 또한 고용될 수 있습니다.
결합된 진피 및 표피 구조물의 체적 화상 진찰은 VHSE에서 더 깊은 레이저 감쇠 때문에 도전적일 수 있습니다. 이는 표피측(도 1)과진피 측(도2)으로부터두 방향으로 컨스트럭쳐하여 진피 혈관 구조및 표피의 좋은 해상도를 허용함으로써 완화될 수 있다. 또한 샘플을 지울 수 있으므로 전체 구조의 체적 이미지를 최소화하여 감쇠가 최소화할 수 있습니다. 여러 클리어링 방법을 시도했지만, 메탄올/메틸 살리실레이트 방법은 최상의 결과를 산출했다. 다른 클리어링 방법을 최적화하는 데 관심이 있는 연구자들은 이러한 리뷰49,61,62를대상으로 합니다. 클리어링하는 경우, 방법이 형광및/또는 구조를 손상시킬 수 있으므로, 클리어하기 전에 샘플을 완전히 이미지화하는 것이 좋습니다. 또한, 형광이 며칠 내에 퇴색할 수 있기 때문에, 이미징은 청산 후 가능한 한 빨리 완료되어야 합니다.
단순성과 접근성을 위해 이 프로토콜은 이전 문헌11,80에서가장 간단한 미디어 블렌드를 활용했다. 간단한 미디어 블렌드를 사용하는 데는 많은 장점이 있지만 이 선택의 한계도 인식됩니다. 다른 그룹은 표피와 진피 건강에 특정 미디어 구성 요소의 효과를 연구하고 다른 미디어 첨가제(94,외부 자유 지방산 / 지질 등, 표피의 층 각막을 강화하고 피부 장벽 기능을 향상 발견. 우리의 면역 형광 마커는 표피에서 적절한 분화 및 계층화를 보여주지만, 수행되는 연구에 따라 추가 적인 미디어 최적화가 필요할 수 있습니다. 또한, 여기에 제시된 VHS를 평가할 때 표피 BM에 대한 광범위한 분석은 수행되지 않았다. BM의 무결성은 피부 등가물의 중요한 표시입니다; 다양한 그룹은 BM표시(95)에 대한 배양 지속 시간 및 그 영향에 대한 연구뿐만 아니라 섬유아세포 존재의 분석및 BM발현(14)에대한 성장 인자 효과를 추가했다. 이 프로토콜을 사용할 때 BM 구성 요소의 분석을 평가하고 최적화해야 합니다.
이 프로토콜에서 VHSE 생성에 대한 절차를 설명하며, ALI에서 8주 후에 결과를 입증합니다. VHSE 배양은 눈에 띄는 변화 또는 생존력의 손실없이 ALI에서 최대 12 주 까지 배양되었으며, 더 이상 실행 가능 할 수 있습니다. 중요한 것은, 이 프로토콜은 IMR90 폐 섬유아세포로 진피 섬유아세포의 교체에 의해 입증된 바와 같이, 일반적으로 이용 가능한 세포 모형에 쉽게 적응할 수 있습니다. 연구원의 필요와 사용 가능한 자원에 따라, 더 유사한 세포 모형이 미디어 최적화를 요구할 수 있더라도, 문화에 세포 모형 및 매체 혼합을 조정할 수 있습니다. 요약하자면, 이러한 절차는 피부 생물학 과 질병의 연구를 위한 VHSEs의 문화에 대한 명확성을 제공하기 위한 것입니다. 접근성을 극대화하기 위해 이 프로토콜은 연구 연구의 특정 요구에 맞게 더욱 사용자 정의할 수 있는 최소한의 효과적인 접근 법으로 공통 장비, 세포주 및 시약을 사용하여 간단하고 견고한 개발되었습니다.
The authors have nothing to disclose.
저자는 짐 라인발트 박사(59)와 박사 엘렌 H. 반 덴 보가르드20 N / TERT 세포주의 관대 한 선물에 감사드립니다. 이 작품은 미국 심장 협회 (19IPLOI34760636)에 의해 지원되었다.
1 N NaOH | Fisher Chemical | S318-100 | (Dilute from Lab stock) |
4% Paraformaldehyde | ACROS Organics | #41678-5000, Lot # B0143461 | Made up using solid Paraformaldehyde in PBS, pH adjusted to 6.9 |
Autoclaved forceps | Fine Science Tools | #11295-00 | Dumont #5 forceps |
CaCl2 | Fisher bioreagents | Cat # BP510-250, Lot # 190231 | Rnase, Dnase, Protease-Free |
Cell line, Endothelial: Microvascular Endothelial Cell (HMEC1) | ATCC | CRL-3243 | SV40 Immortalized microvascular endothelial cell. Note that 750,000 cells/mL of collagen were used. |
Cell line, Fibroblasts: dermal Human fibroblast, adult | ATCC | PCS-201-012 | Primary dermal cells. Note that 75,000 cells/mL of collagen were used. |
Cell line, Fibroblasts: human lung firbroblast (IMR90) | ATCC | CCL-186 | Primary embryonic cells. Note that 75,000 cells/mL of collagen were used. |
Cell line, Keratinocyte: N/TERT-1 | Immortalized via hTERT expression. N/TERT-1 was made using a retroviral vector conferring hygromycin resistance. Cell line established by Dickson et al. 2000. Can be replaced with ATCC PCS-200-010 or PCS-200-011. Note that 170,000 cells were used per construct; N/TERT1 cells must be used from plates that are 30% confluent- two 30% confluent 90 mm tissue culture dishes give more than enough cells.The authors thank Dr. Jim Rheinwald and Dr. Ellen H. van den Bogaard for their generous gift of N/TERT cell lines. | ||
Centrifuge | Thermo Scientific; Sorvall Legend X1R | (standard lab equipment) | |
Computational Software | MATLAB | MATLAB 2020a | MathWorks, Natick, MA. |
Confocal Microscope | Leica TCS SPEII confocal | Laser scanning confocal. Can be replaced with other confocals or deconvolution microscopy. | |
Cover Glass (22 x 22) | Fisher Scientific | 12-545F | 0.13-0.17 mm No.1 Thickness |
Cyanoacrylate super glue or silicone grease | Glue Masters | #THI0102 | Glue Masters, THICK, Instant Glue, Cyanoacrylate; super glue is preferred |
DMEM media base | Corning; Mediatech, Inc | REF # 10-013-CM; Lot # 26119007 | DMEM, 1X (Dulbecco's Modification of Eagle's Medium) with 4.5 g/L glucose, L-glutamine & sodium pyruvate |
DMEM/F-12 50/50 | Corning; Mediatech, Inc | REF # 10-090-CV; Lot # 21119006 | DMEM/F-12 50/50, 1X (Dulbecco's Mod. Of Eagle's Medium/Ham's F12 50/50 Mix) with L-glutamine |
Ethanol | Decon Labs | #V1101 | (standard lab reagent) |
Fetal Bovine Serum | Fisher Scientific | Cat # FB12999102, Lot # AE29451050 | Research Grade Fetal Bovine Serum, Triple 0.1 um sterile filtered |
Fine tip forceps | Fine Science Tools | #11295-00 | Dumont #5 forceps |
Human Epidermal Growth Factor (EGF) | Peprotech | Cat # AF-100-15-1MG, Lot # 0318AFC05 D0218 | Made up in 0.1% BSA in PBS |
Hydrocortisone | Alpha Easar | Lot # 5002F2A | made up in DMSO |
Insulin (human) | Peprotech | Lot # 9352621 | |
Inverted Light/Phase Contrast Microscope | VWR | 76317-470 | (standard lab equipment) |
Isoproterenol | Alfa Aesar | #AAJ6178806 | DL-Isoproterenol hydrochloride, 98% |
Keratinocyte-SFM (1x) media base | Gibco; Life Technologies Corporation | REF #: 10724-011; Lot # 2085518 | Keratinocyte-SFM (1X); serum free medium |
L-Ascorbic Acid | Fisher Chemical | Cat # A61-100, Lot # 181977, CAS # 50-81-7 | Crystalline. L-Ascorbic acid can also be purchased as a salt |
L-glutamine (solid) | Fisher Bioreagents | CAT # BP379-100, LOT # 172183, CAS # 56-85-9 | L-Glutamine, white crystals or Crystalline powder |
MCDB 131 media base | Gen Depot | CM034-050, Lot # 03062021 | MCDB 131 Medium Base, No L-Glutamine, sterile filtered |
Metal punches | Sona Enterprises (SE) | 791LP, 12PC | Hollow Leather Punch Set, High Carbon Steel, Hardness: 48HRC; (various sizes including): 1/8", 5/32", 3/16", 7/32", 1/4", 9/32", 5/16", 3/4", 7/16", 1/2", 5/8:, 3/4". This punch set is helpful, but x-acto knife can work as well. Size of metal punch that works well for 12 well transwell VHSE is 3/8" or 1/2". |
Methanol | Fisher Chemical | CAS # 67-56-1 | (optional). For clearing dehydration step. |
Methyl Salicylate | Fisher Chemical | O3695-500; Lot # 164535; CAS # 119-36-8 | (optional). For clearing. |
Microtubes, 1.7 mL | Genesee Scientific Corporation; Olympus Plastics | Cat # 24-282; Lot # 19467 | 1.7 ml Microtubes, Clear; Boilproof, Polypropulene, Certified Rnase, Dnase, DNA, PCR inhibitor and endotoxin-Free |
PBS, 10x Culture grade or autoclaved | APEX Bioresearch Products | Cat # 20-134, Lot # 202237 | PBS Buffer, 10x Dry Pack; add contents of pack into container and add water to 1 liter to produce 10x concentrated. |
PBS, 1x Culture grade, (-) Calcium, (-) magnesium | Genesee Scientific Corporation | Ref # 25-508; Lot # 07171015 | |
PBS, 1x non-Culture grade | APEX Bioresearch Products | Cat # 20-134, Lot # 202237 | PBS Buffer, 10x Dry Pack; add contents of pack into container and add water to 1 liter to produce 10x concentrated. Dilute to 1x with water. |
Penicillin/Streptomycin | Gibco; Life Technologies Corporation | Ref # 15140-122, Lot # 2199839 | Pen Strep (10,000 Units/mL Penicillin; 10,000 ug/mL Streptomycin) |
Petri Dish, glass, small | Corning | PYREX 316060 | (optional). To be used as a clearing container |
Petri Dishes, 100 mm | Fisher Scientific | FB0875713 | Use for making up PDMS. |
Polydimethylsiloxane (PDMS) | Dow Corning | GMID 02065622, Batch # H04719H035 | Sylgard 184 Silicone Elastomer Base, Dow Corning, Midland, MI) |
Dow Corning | GMID 02065622, Batch # H047JC4003 | DOWSIL 184, Silicone Elastomer Curing Agent | |
note: PDMS is usually sold as a kit that includes both the base and curing agent components. | |||
Positive Displacement Pipettes (1000 & 250 uL) | Gilson | 1000 uL: HM05136, M1000. 250 uL: T12269L | M1000 pipette capacity (100-1000 uL); M250 pipette capacity to 250 uL |
Positive Displacement Tips/Pistons (1000 & 250 uL) | Gilson | 1000 uL: CAT # F148180, BATCH # B01292902S; 250 uL: CAT # F148114, BATCH # B05549718S | Sterilized capillaries and pistons |
Round tipped scoopula | (optional; standard lab equipment) For manipulation of VHSEs prior to imaging | ||
Supplements for Keratinocyte-SFM media | Gibco; Life Technologies Corporation | Ref # 37000-015, Lot # 2154180 | Contains EGF Human Recombinant (Cat # 10450-013), Bovine Pituitary Extract (Cat # 13028-014) |
Tissue Culture Plate Inserts, 12 well size, 3 µm pore size | Corning; Costar | REF # 3462 – Clear; Lot # 14919057 | Transwell; 12 mm Diameter Inserts, 3.0 um pore size, tissue culture treated, polyester membrane, polystyrene plates, |
Tissue Culture Plates, 12 well size | Greiner Bio-one; CellStar | Cat # 665 180; Lot # E18103QT | 12 well cell culture plate; sterile, with lid; products are sterile, free of detectable Dnase, Rnase, human DNA and pyrogens. Contents non-cytotoxic |
Tissue Culture Plates, 60.8cm^2 growth area | Genesee Scientific Corporation | Cat # 25-202; Lot No: 191218-177B | Tissue culture dishes; treated, growth area 60.8 cm^2; sterile, Dnase, Rnase, Pyrogen Free; virgin polystyrene |
Triton x 100 | Ricca Chemical Company | Cat # 8698.5-16, Lot # 4708R34 | Wetting agent |
Trypsin 0.25% | Corning; Mediatech, Inc | Ref # 25-053-CI | 0.25% Trypsin, 2.21 mM EDTA, 1x [-] sodium bicarbonate |
Type 1 Collagen isolated from Rat tail | Pel-Freez Biologicals | 56054-1 | Sprauge-Dawley rat tails can be purchased frozen from Pel-Freez or other suppliers. Collagen can be isolated from the tail tendons. Isolation Protocol references [Cross et al.,2010; Rajan et al.,2007; Bornstein, 1958] .Alternatively, high concentration rat-tail collagen can be purchased from suppliers including Corning (Catalog Number: 354249) |
Vaccum chamber, benchtop | Bel-Art | F42010-0000 | (standard lab equipment) |
Handheld Precision knife | X-Acto | X3311 | (X-Acto knife optional if purchased steel punches) |