환자 유래 종양은 환자의 약물 내성을 예측하기위한 "라이브"전임상 플랫폼으로 이월합니다.
Summary
이 논문은 살아있는 환자 관련 전임상 모델 시스템에서 종양 약물 반응을 평가하기 위한 환자 유래 각종의 생성, 약물 치료 및 분석을 위한 방법을 설명합니다.
Abstract
약물 내성의 이해와 고저항성 암을 민감하게 하기 위한 새로운 전략의 개발은 환자 반응을 정확하게 예측할 수 있는 적합한 전임상 모델의 가용성에 의존합니다. 기존 전임상 모델의 단점 중 하나는 인간 종양 미세환경(TME)을 문맥적으로 보존하고 종양 내 이질성을 정확하게 나타내지 못해 데이터의 임상번역을 제한하는 것이다. 대조적으로, 인간 종양의 살아있는 단편의 문화를 대표함으로써, 환자 유래 한 절제 (PDE) 플랫폼은 원래 종양의 병리학 적 및 건축 적 특징을 가능한 한 가깝게 반영하는 3차원 (3D) 맥락에서 약물 반응을 검사 할 수 있게합니다. PDEs를 가진 이전 보고는 화학 저항하는 종양에서 화학반응을 구별하는 플랫폼의 기능을 문서화하고, 이 분리는 동일 화학요법에 참을성 있는 반응의 예측이다는 것을 보여주었습니다. 동시에, PDEs는 약물 반응을 예측하는 종양의 분자, 유전 적 및 조직학적 특징을 심문할 수 있게 하여 환자 계층화에 대한 바이오마커와 내성 종양에 민감하게 반응하는 새로운 중재 적 접근법을 식별할 수 있습니다. 이 논문은 환자 샘플 수집부터 끝점 분석에 이르기까지 PDE 방법론을 자세히 보고합니다. 그것은 특정 종양에 대한 맞춤형 조건을 강조, 절제 파생 및 배양 방법에 대한 자세한 설명을 제공합니다, 적절한 경우. 엔드포인트 분석을 위해, 종양 및 기질 영역 내의 주요 바이오마커의 공간 프로파일링을 위한 멀티플렉스 면역 형광 및 다중 스펙트럼 이미징에 초점이 있다. 이러한 방법을 결합함으로써, 다양한 임상 병리학 파라미터와 관련될 수 있는 정량적 및 질적 약물 반응 데이터를 생성하여 잠재적으로 바이오마커 식별에 사용될 수 있다.
Introduction
효과적이고 안전한 항암제의 개발은 예측 및 약동적 바이오마커의 식별을 용이하게 할 수 있는 작용 메커니즘에 대한 통찰력을 제공할 수 있는 적절한 전임상 모델이 필요합니다. 종양 간 이질성1,2,3,4,5 및 TME6,7,8,9,10,11,12는 항암제 반응에 영향을 미치는 것으로 알려져 있으며, 세포주, 오르가노이드 및 마우스 모델과 같은 많은 기존 전임상 암 모델은 이러한 결정적인 것을 완전히 수용할 수 없다. 기능. “이상적인” 모델은 종양 내의 비악성 세포와 악성종양의 복잡한 공간 상호 작용을 재구성할 수 있을 뿐만 아니라 종양 내의 지역적 차이를 반영할 수 있는 모델입니다. 이 문서에서는 이러한 요구 사항 중 많은 것을 충족할 수 있는 신흥 플랫폼인 PDEs에 중점을둡니다(13)
또한 조직문화로 알려진 인간 PdEs의 사용의 첫 번째 예는 호프만 등 새로 절제된 인간 종양의 조각을 생성하고 콜라겐 매트릭스14,15에서배양 할 때 1980 년대 후반으로 거슬러 올라간다. 이것은 조직 건축을 보존하는 3D 배양 시스템을 설치하여 TME 내의 기질 성분 및 세포 상호 작용의 유지를 보장하는 것을 포함했습니다. 원래 종양을 해체하지 않고, 호프만 외16 번역 연구의 새로운 접근을 예고하고, 이 시간 이후, 많은 그룹은 조직 무결성을 보존하고 정확한 약물 반응 데이터를 생성하는 것을 목표로 다른 각질 방법을 최적화했다17,18,19,21,21,22,23,24 프로토콜 간의 몇 가지 차이점이 분명하지만. 버틀러 외. 젤라틴 스폰지에서 배양된 박기는표본(20,21,25)을통해 영양분과 약물의 확산을 돕는 반면, Majumder 등은 동일한환자로부터유래된 자가혈류의 존재에서 종양과 기질 단백질로 구성된 매트릭스 위에 박리하여 종양 생태계를조성하였다. 23.
최근에는배양시스템(24)의공기-액체 인터페이스에서 투과성 멤브레인에 추가 성분없이 배치되는2-3mm 크기의크기의 조각으로 종양의 단편화에 의해 각질이 발생하는 프로토콜을 설정하였다. 종합하면, 이러한 수많은 연구는 PDEs가 원래 종양의 공간 건축 과 지역 이질성을 유지하는 인간의 종양의 손상되지 않은 살아있는 단편의 문화를 허용한다는 것을 입증했습니다. 본래 실험에서, 박종 또는 히스토컬은 일반적으로 약물 치료에 따라 균질화를 실시하였다. 그 후 히스토처형 약물 반응분석20,21,MTT(3-(6)-2,5-디페닐테트라졸륨 브로마이드) 분석, 락테이트 탈수소효소 분석, 또는 레자쥐린 계 의 분석26,27,288, 288 . 최근 엔드포인트 분석 기술, 특히 디지털 병리학의 진행은 이제29,30에서수행 할 수있는 엔드포인트 테스트 및 분석의 레퍼토리를 확장했습니다. 이러한 새로운 기술을 적용하려면 균질화 대신 파라핀(FFPE)에 내장된 후 면역염색 기술을 사용하여 분석하여 공간 프로파일링을 허용합니다. 이러한 접근법의 예는 비소세포폐암(NSCLC), 유방암, 대장암 및 중피종 에 대해 문서화되어 증식 마커, Ki67, 및 세포식 마커, 갈라진 다중 ADP 리보스 폴리모제 폴리머라제(cPARP) 및 세포증식의변화를 모니터링하는 데 사용되었다,34, 34,세포 증식 및세포증식 및 세포 증식및 세포 증식, 34.
멀티플렉스 면역 형광은 종점35에서이분야에서 약물 반응의 공간 프로파일링을 위해 특히 순종한다. 예를 들어, 대식세포 나 T 세포와 같은 면역 세포의 특정 클래스의 재현지화 및 공간 분포를 측정할 수 있으며, 약물 치료 시 TME 내에서13,36,37,38,치료제가 “감기종양”에서 “뜨거운 종양”으로의 전환을 선호할 수 있는지 여부를 조사할 수있다. . 최근 몇 년 동안, 이 그룹은 다른 종양 유형(NSCLC, 신장암, 유방암, 대장암, 흑색종)과 화학요법, 소분자 억제제 및 면역 체크포인트 억제제(ICI)를 포함한 다양한 항암제의 시험에서 PDE의 파생에 초점을 맞추고 있다. 엔드포인트 분석 방법은 TME의 다른 성분을 위한 바이오마커뿐만 아니라 생존을 위한 바이오마커의 공간 프로파일링을 허용하기 위해 멀티플렉스 면역 형광을 포함하도록 최적화되었습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 논문은 PdEs의 생성, 약물 치료 및 분석을 위한 방법을 설명하고 전임상 모델 시스템으로 플랫폼의 장점을 강조합니다. 그 분해를 포함하지 않는 갓 절제된 종양의 전 생체 배양은 종양아키텍처(13,24)의 보존을 허용하므로 TME의 세포 성분의 공간 상호 작용뿐만 아니라 종양 내 이질성. 이 방법은 종양 특이적 마커를 사용하여, 스트로마 영역대 종양 조?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 외과 절제 된 종양 조직을 제공 에 대한 레스터 NHS 트러스트의 대학 병원에서 외과 의사와 병리학자 감사합니다. 우리는 또한 VEctra 폴라리스의 사용과 지원을 위해 FFPE 조직 블록과 키스 스트라트만의 조직 처리 및 단면에 도움을 핵심 생명 공학 서비스 내의 조직학 시설에 감사드립니다. 이 연구는 레스터 대학, MRC 독성학 단위, 암 연구 영국 치료 발견 실험실 및 LifeArc: 4개의 파트너로 구성된 Explant 컨소시엄에 의해 지원되고 투자되었습니다. 추가 지원은 CRUK-NIHR 레스터 실험암 의학 센터에 의해 제공되었습니다 (C10604/A25151). GM에 대 한 자금, CD, 그리고 NA 유방암 지금의 촉매 프로그램에 의해 제공 되었다 (2017NOVPCC1066), 화이자에서 자금에 의해 지원 됩니다.
Materials
| Acetic acid | Sigma | 320099 | Staining reagent |
| Antibody Diluent / Block, 1x | Perkin Elmer | ARD1001EA | Antibody diluent/blocking buffer |
| Barnstead NANOpure Diamond | Barnstead | Ultra Pure (UP) H2O machine | |
| Citric Acid Monohydrate | Sigma-Aldrich | C7129 | Reagent for citrate buffer |
| Costar Multiple Well Cell Culture Plates | Corning Incorporated | 3516 | 6 multiwell plate |
| DAPI Dilactate | Life Technologies | D3571 | |
| 100 x 17 mm Dish, Nunclon Delta | ThermoFisher Scientific | 150350 | 100 mm diameter dish for tissue culture |
| DMEM (1x) Dubelcco's Modified Eagle Medium + 4.5 g/L D-Glucose + 110 mg/mL Sodium Pyruvate | Gibco (Life Technologies) | 10569-010 | Tissue culture medium (500 mL) |
| DPX mountant | VWR | 360294H | Mounting medium |
| DPX mountant | Merck | 6522 | Mounting medium |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | 3609 | Reagent for TE buffer |
| Eosin | CellPath | RBC-0100-00A | Staining reagent |
| Foetal Bovine Serum | Gibco | 10500-064 | For use in tissue culture medium |
| 37% Formaldehyde | Fisher (Acros) | 119690010 | 10% Formalin |
| iGenix, microwave oven IG2095 | iGenix | IG2095 | Microwave used for antigen retreival |
| Industrial methylated spirit (IMS) | Genta Medical | 199050 | 99% Industrial Denatured Alcohol (IDA) |
| InForm Advanced Image Analysis Software | Akoya Biosciences | InForm | |
| Leica ASP3000 Tissue Processor | Leica Biosystems | Automated Vacuum Tissue Processor | |
| Leica Arcadia H and C | Leica Biosystems | Embedding wax bath | |
| Leica RM2125RT | Leica Biosystems | Rotary microtome | |
| Leica ST4040 Linear Stainer | Leica Biosystems | H&E stainer | |
| Mayer's Haematoxylin | Sigma | GHS132-1L | Staining reagent |
| Millicell Cell Culture Inserts, 30 mm, hydrophilic PTFE, 0.4 µm | Merck Milipore | PICMORG50 | Organotypic culture insert disc |
| Novolink Polymer Detection System | Leica Biosystems | RE7150-K | DAB staining kit |
| OPAL 480 | Akoya Biosciences | FP1500001KT | Fluorophore with Dimethyl Sulfoxide (DMSO) diluent |
| OPAL 520 | Akoya Biosciences | FP1487001KT | Fluorophore with Dimethyl Sulfoxide (DMSO) diluent |
| OPAL 570 | Akoya Biosciences | FP1488001KT | Fluorophore with Dimethyl Sulfoxide (DMSO) diluent |
| OPAL 620 | Akoya Biosciences | FP1495001KT | Fluorophore with Dimethyl Sulfoxide (DMSO) diluent |
| OPAL 650 | Akoya Biosciences | FP1496001KT | Fluorophore with Dimethyl Sulfoxide (DMSO) diluent |
| OPAL 690 | Akoya Biosciences | FP1497001KT | Fluorophore with Dimethyl Sulfoxide (DMSO) diluent |
| OPAL 780 / OPAL TSA-DIG Reagent | Akoya Biosciences | FP1501001KT | Fluorophore with Dimethyl Sulfoxide (DMSO) diluent and TSA-DIG reagent |
| Opal Polymer HRP Ms Plus Rb, 1x | Perkin Elmer | ARH1001EA | HRP polymer |
| Penicillin/streptomycin solution | Fisher Scientific | 11548876 | For use in tissue culture medium |
| PhenoChart Whole Slide Contextual Viewer | Akoya Biosciences | PhenoChart | Viewer software for scanned images |
| Phosphate Buffered Saline Tablets | Thermo Scientific Oxoid | BR0014G | PBS |
| 1x Plus Amplification Diluent | Perkin Elmer | FP1498 | Fluorophore diluent |
| Prolong Diamond Antifade Mountant | Invitrogen | P36961 | Mounting medium |
| Slide Carrier | Perkin Elmer | To load slides into Slide Carrier Hotel for scanning with Vectra Polaris | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | S/3160/63 | 10% Formalin |
| Sodium Hydroxide pellets | Fisher Scientific | S/4920/53 | Reagent for citrate buffer |
| Tenatex Toughened Wax – Pink (500 g) | KEMDENT | 1-601 | Dental wax surface |
| Thermo Scientific Shandon Sequenza Slide Rack for Immunostaining Center | Fisher Scientific | 10098889 | Holder for slides and slide clips |
| Thermo Scientific Shandon Plastic Coverplates | Fisher Scientific | 11927774 | Slide clips |
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane (Tris) | Sigma-Aldrich | 252859 | Reagent for TE buffer |
| VectaShield | Vecta Laboratories | H-1000-10 | Mounting medium |
| Vectra Polaris Slide Scanner | Perkin Elmer | Vectra Polaris | Slide scanner |
| Xylene | Genta Medical | XYL050 | De-waxing agent |
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