Isolement et imagerie en accéléré de cellules de mésenchyme palatales embryonnaires primaires de souris pour analyser les attributs de mouvement collectif
Summary
Nous présentons un protocole d’isolement et de culture de cellules mésenchymateuses palatales embryonnaires primaires de souris pour l’imagerie en accéléré de la croissance bidimensionnelle (2D) et des tests de réparation des plaies. Nous fournissons également la méthodologie d’analyse des données d’imagerie time-lapse afin de déterminer la formation de flux cellulaire et la motilité directionnelle.
Abstract
Le développement du palais est un processus dynamique, qui implique la croissance verticale des étagères palatines bilatérales à côté de la langue, suivie d’une élévation et d’une fusion au-dessus de la langue. Les défauts de ce processus entraînent une fente palatine, une anomalie congénitale courante. Des études récentes ont montré que l’élévation de la plate-forme palatale implique un processus de remodelage qui transforme l’orientation de l’étagère d’une verticale à une horizontale. Le rôle des cellules mésenchymateuses du plateau palatal dans ce remodelage dynamique a été difficile à étudier. L’analyse quantitative basée sur l’imagerie time-lapse a récemment été utilisée pour montrer que les cellules mésenchymateuses palatales embryonnaires primaires de souris (MEPM) peuvent s’auto-organiser en un mouvement collectif. Des analyses quantitatives ont pu identifier des différences dans les cellules MEPM mutantes à partir d’un modèle murin présentant des défauts d’élévation du palais. Cet article décrit des méthodes pour isoler et mettre en culture des cellules MEPM à partir d’embryons E13.5 – spécifiquement pour l’imagerie time-lapse – et pour déterminer divers attributs cellulaires du mouvement collectif, y compris des mesures de formation de flux, d’alignement de forme et de persistance de la direction. Il postule que les cellules MEPM peuvent servir de modèle proxy pour étudier le rôle du mésenchyme du plateau palatal pendant le processus dynamique d’élévation. Ces méthodes quantitatives permettront aux chercheurs dans le domaine craniofacial d’évaluer et de comparer les attributs de mouvement collectif dans les cellules témoins et mutantes, ce qui améliorera la compréhension du remodelage mésenchymateux pendant l’élévation du plateau palatal. De plus, les cellules MEPM fournissent un modèle cellulaire mésenchymateux rare pour l’étude du mouvement cellulaire collectif en général.
Introduction
Le développement du palais a été largement étudié car les défauts de la palatogenèse conduisent à une fente palatine – une anomalie congénitale courante qui survient dans des cas isolés ou dans le cadre de centaines de syndromes1,2. Le développement du palais embryonnaire est un processus dynamique qui implique le mouvement et la fusion du tissu embryonnaire. Ce processus peut être divisé en quatre étapes principales: 1) induction des étagères palatales, 2) croissance verticale des étagères palatales à côté de la langue, 3) élévation des étagères palatales au-dessus de la langue et 4) fusion des étagères palatales à la ligne médiane1,3,4. Au cours des dernières décennies, de nombreux mutants de souris ont été identifiés qui manifestent une fente palatine5,6,7,8. La caractérisation de ces modèles a révélé des défauts dans les étapes d’induction, de prolifération et de fusion du plateau palatal; cependant, les défauts d’élévation de l’étagère palatale ont été rares. Ainsi, la compréhension de la dynamique de l’élévation du plateau palatal est un domaine de recherche intrigant.
Une analyse minutieuse de certains mutants de souris présentant des défauts d’élévation de la plate-forme palatine a conduit au modèle actuel montrant que la région très antérieure de la tablette palatine semble se retourner, tandis qu’un mouvement vertical à horizontal ou un « remodelage » des étagères palatines se produit dans les régions moyennes à postérieures du palais1,3,4, 9,10,11. L’épithélium du bord médial de la plate-forme palatine initie probablement la signalisation requise pour ce remodelage, qui est ensuite entraînée par le mésenchyme de la plate-forme palatine. Récemment, de nombreux chercheurs ont identifié un retard d’élévation du plateau palatal dans des modèles murins qui ont montré des adhérences orales transitoires impliquant des étagères palatales12,13. Le remodelage mésenchymateux implique une réorganisation des cellules pour créer un renflement dans la direction horizontale, tout en rétractant simultanément la plate-forme palatine dans la direction verticale9,10,14. Parmi les nombreux mécanismes proposés pour affecter l’élévation du plateau palatal et le remodelage mésenchymateux sous-jacent figurent la prolifération cellulaire15,16,17, les gradients chimiotactiques18et les composants de la matrice extracellulaire19,20. Une question importante s’est posée : le retard d’élévation du plateau palatal observé chez les souris déficientes en Specc1l est-ilégalement dû en partie à un défaut de remodelage du plateau palatal, et ce défaut de remodelage pourrait-il se manifester par un défaut intrinsèque de comportement des cellules MEPM primaires21?
Les cellules MEPM primaires ont été utilisées dans le domaine craniofacial pour de nombreuses études impliquantl’expressiongénique 22,23,24,25,26,27,28,29, et quelques-unes impliquant la prolifération30,31 et la migration25,31,32 , mais aucun pour l’analyse collective du comportement cellulaire. L’imagerie en accéléré des cellules MEPM a été réalisée dans des tests de culture 2D et de réparation des plaies pour montrer que les cellules MEPM présentaient un mouvement directionnel et formaient des flux cellulaires dépendants de la densité – attributs du mouvement collectif21. De plus, les cellules mutantes Specc1l formaient des flux cellulaires plus étroits et présentaient des trajectoires de migration cellulaire très variables. Ce manque de motilité coordonnée est considéré comme contribue au retard d’élévation du palais chez les embryons mutants Specc1l 13,21. Ainsi, ces essais relativement simples utilisant des cellules MEPM primaires peuvent servir de proxy pour l’étude du remodelage mésenchymateux pendant l’élévation du plateau palatal. Cet article décrit l’isolement et la culture des cellules MEPM primaires, ainsi que l’imagerie et l’analyse en accéléré, pour les tests 2D et de réparation des plaies.
Protocol
Representative Results
Discussion
L’élévation du plateau palatal constitue un événement de remodelage vertical à horizontal1,3,4,9,11. Il est postulé que ce processus de remodelage nécessite que les cellules mésenchymateuses du plateau palatal se comportent de manière coordonnée. Les analyses avec des cellules MEPM de type sauvage montrent que ce comportement cellulaire est intrins…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce projet a été soutenu en partie par les subventions des National Institutes of Health DE026172 (I.S.) et GM102801 (A.C.). I.S. a également été soutenu en partie par la subvention du Center of Biomedical Research Excellence (COBRE) (National Institute of General Medical Sciences P20 GM104936), la subvention du Kansas IDeA Network for Biomedical Research Excellence (National Institute of General Medical Sciences P20 GM103418) et la subvention du Kansas Intellectual and Developmental Disabilities Research Center (KIDDRC) (U54 Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development, HD090216).
Materials
| Beaker, 250 mL (x2) | Fisher Scientific | FB-100-250 | |
| CO2 | Matheson Gas | UN1013 | |
| Conical tubes, 15 mL (x1) | Midwest Scientific | C15B | |
| Debian operating system | computational analysis of time-lapse images | ||
| Dulbecco's Modified Eagles Medium/High Glucose with 4 mM L-Glutamine and Sodium Pyruvate | Cytiva Life Sciences | SH30243.01 | |
| EtOH, 100% | Decon Laboratories | 2701 | |
| EVOS FL Auto | ThermoFisher Scientific | AMAFD1000 | |
| EVOS Onstage Incubator | ThermoFisher Scientific | AMC1000 | |
| EVOS Onstage Vessel Holder, Multi-Well Plates | ThermoFisher Scientific | AMEPVH028 | |
| Fetal Bovine Serum | Corning | 35-010-CV | |
| Fine point #5 Stainless Steel Forceps (x2) | Fine Science Tools | 11295-10 | Dissection |
| Instrument sterilizer bead bath | Fine Science Tools | 18000-45 | |
| Microcetrifuge tubes, 1.5mL | Avant | 2925 | |
| Micro-Dissecting Stainless Steel Scissors, Straight | Roboz | RS-5910 | Dissection |
| NucBlue (Hoechst) Live Ready Probes | ThermoFisher Scientific | R37605 | |
| Penicillin Streptomycin Solution, 100x | Corning | 30-002-CI | |
| Silicone Insert, 2-well | Ibidi | 80209 | |
| Small Perforated Stainless Steel Spoon | Fine Science Tools | MC17C | Dissection |
| Spring Scissors, 4 mm | Fine Science Tools | 15018-10 | |
| Sterile 10 cm dishe(s) | Corning | 430293 | |
| Sterile 12-well plate(s) | PR1MA | 667512 | |
| Sterile 6-well plate(s) | Thermo Fisher Scientific | 140675 | |
| Sterile PBS | Corning | 21-031-CV | |
| Sterile plastic bulb transfer pipette | ThermoFisher Scientific | 202-1S | |
| Trypsin, 0.25% | ThermoFisher Scientific | 25200056 |
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