Summary
Het doel van deze studie was om te bepalen of nanodeeltjestrackinganalyse (NTA) urinecalcium met nanokristallen van gezonde volwassenen kon detecteren en kwantificeren. De bevindingen van de huidige studie suggereren dat NTA een potentieel hulpmiddel kan zijn om urinaire nanokristallen tijdens niersteenziekte te schatten.
Abstract
Nierstenen komen wereldwijd steeds vaker voor bij volwassenen en kinderen. De meest voorkomende soort niersteen bestaat uit calciumoxalaat (CaOx) kristallen. Kristallurie treedt op wanneer urine oververzadigd raakt met mineralen (bijv. calcium, oxalaat, fosfaat) en voorafgaat aan de vorming van niersteen. Standaardmethoden om kristallurie in steenvormers te beoordelen, omvatten microscopie, filtratie en centrifugeren. Deze methoden detecteren echter voornamelijk microkristallen en geen nanokristallen. Nanokristallen zijn in vitro schadelijker voor nierepitheelcellen dan microkristallen. Hier beschrijven we het vermogen van Nanoparticle Tracking analysis (NTA) om menselijke nanokristallen in de urine te detecteren. Gezonde volwassenen kregen een gecontroleerd oxalaatdieet voordat ze een oxalaatbelasting dronken om nanokristallen in de urine te stimuleren. Urine werd 24 uur voor en na de oxalaatbelasting verzameld. Monsters werden verwerkt en gewassen met ethanol om monsters te zuiveren. Urine nanokristallen waren bevlekt met de calciumbindende fluorofoor, Fluo-4 AM. Na het kleuren werden de grootte en het aantal nanokristallen bepaald met behulp van NTA. De bevindingen van deze studie tonen aan dat NTA nanokristallurie efficiënt kan detecteren bij gezonde volwassenen. Deze bevindingen suggereren dat NTA een waardevolle vroege detectiemethode van nanokristallijne bij patiënten met niersteenziekte kan zijn.
Introduction
Urinekristallen vormen zich wanneer urine oververzadigd raakt met mineralen. Dit kan voorkomen bij gezonde personen, maar komt vaker voor bij personen met nierstenen1. De aanwezigheid en accumulatie van urinekristallen kan het risico op het ontwikkelen van een niersteen verhogen. In het bijzonder gebeurt dit wanneer kristallen zich binden aan Randall's plaque, nucleeren, accumuleren en groeien in de loop van de tijd2,3,4. Crystalluria gaat vooraf aan de vorming van nierstenen en de beoordeling van kristallurie kan voorspellende waarde hebben in niersteenvormers3,5. In het bijzonder is gesuggereerd dat kristallurie nuttig is om het risico op steenrecidief te voorspellen bij patiënten met een voorgeschiedenis van calciumoxalaat dat stenenbevat 6,7.
Er is gemeld dat kristallen een negatieve invloed hebben op de nierepitheel- en circulerende immuuncelfunctie8,9,10,11,12,13. Eerder is gemeld dat circulerende monocyten uit calciumoxalaat (CaOx) niersteen voormalige cellulaire bio-energetica hebben onderdrukt in vergelijking met gezonde individuen14. Bovendien verminderen CaOx-kristallen cellulaire bio-energetica en verstoren ze de redoxhomeostase in monocyten8. Consumptie van maaltijden die rijk zijn aan oxalaat kan kristallurie veroorzaken, wat kan leiden tot schade aan de niertubulus en de productie en functie van macromoleculen in de urine kan veranderen die beschermen tegen niersteenvorming15,16. Verschillende studies hebben aangetoond dat urinekristallen kunnen variëren in vorm en grootte, afhankelijk van de pH en temperatuur van de urine17,18,19. Verder is aangetoond dat urine-eiwitten kristalgedrag moduleren20. Daudon et al.19, stelden voor dat kristalluria-analyse nuttig zou kunnen zijn bij de behandeling van patiënten met niersteenziekte en bij het beoordelen van hun reactie op therapieën. Enkele conventionele methoden die momenteel beschikbaar zijn om de aanwezigheid van kristallen te evalueren , zijn gepolariseerde microscopie21,22, elektronenmicroscopie23, deeltjestellers3, urinefiltratie24, verdamping3,5 of centrifugeren21. Deze studies hebben waardevol inzicht gegeven in het niersteenveld met betrekking tot kristallurie. Een beperking van deze methoden was echter het onvermogen om kristallen van minder dan 1 μm groot te visualiseren en te kwantificeren. Kristallen van deze grootte kunnen de groei van CaOx-stenen beïnvloeden door zich aan Randalls plaquette te hechten.
Nanokristallen blijken uitgebreide schade aan niercellen te veroorzaken in vergelijking met grotere microkristallen25. De aanwezigheid van nanokristallen is gemeld in de urine met behulp van een nanodeeltjesanalysator26,27. Recente studies hebben fluorescerend gelabelde bisfosfaatsondes (alendronaat-fluoresceïne/alendronaat-Cy5) gebruikt om nanokristallen te onderzoeken met behulp van nanoschaalstroomcytometrie28. De beperking van deze kleurstof is dat het niet specifiek is en zich zal binden aan bijna alle soorten stenen behalve cysteïne. Het nauwkeurig beoordelen van de aanwezigheid van nanokristallen bij individuen kan dus een effectief hulpmiddel zijn om kristallurie te diagnosticeren en/of steenrisico te voorspellen. Het doel van deze studie was om calcium bevattende nanokristallen (<1 μm groot) te detecteren en te kwantificeren met behulp van nanodeeltjestrackinganalyse (NTA). Om dit te bereiken, werd NTA-technologie gebruikt in combinatie met een calciumbindende fluorofoor, Fluo-4 AM om calcium met nanokristallen in de urine van gezonde volwassenen te detecteren en te kwantificeren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle experimenten die in dit werk worden beschreven, zijn goedgekeurd door de University of Alabama in Birmingham (UAB) Institutional Review Board. Gezonde volwassenen (33,6 ± 3,3 jaar oud; n=10) werden in het onderzoek ingeschreven als ze een normaal uitgebreid metabolisch bloed hadden, niet-tabaksgebruikers, niet-zwanger, een BMI tussen 20-30 kg/m2, en vrij van chronische medische aandoeningen of acute ziekten. Gezonde deelnemers ondertekenden een schriftelijk formulier voor geïnformeerde toestemming voorafgaand aan de start van het onderzoek.
1. Klinisch protocol en urineafname
- Laat deelnemers een laag oxalaatdieet consumeren dat is bereid door het UAB Center for Clinical and Translational Sciences Bionutrition Core gedurende 3 dagen en 's nachts snel voordat ze hun urine verzamelen (24-uursmonster).
- Laat deelnemers de volgende dag hun 24-uurs urinemonster (pre-oxalaat) retourneren voordat ze een oxalaatlading consumeren (smoothie met fruit en groenten, ~ 8 mM oxalaat). Laat deelnemers vervolgens 24 uur lang hun urine verzamelen (post-oxalaatmonster) en de volgende dag hun urine terugbrengen.
- Houd alle urinemonsters vóór verwerking op kamertemperatuur (RT) zoals hieronder beschreven en weergegeven in figuur 1.
2. Urineverwerking
OPMERKING: Alle gebruikte materialen en apparatuur zijn opgenomen in de tabel met materialen.
LET OP: Draag te allen tijde persoonlijke beschermingsmiddelen tijdens het hanteren van klinische monsters en reagentia. Met name handschoenen, gezichts- en oogschilden, ademhalingsbescherming en beschermende kleding.
- Meet en registreer de pH en het volume van de urine. Meng grondig voordat u 50 ml urine toevoegt aan een gelabeld steriele conische buis van 50 ml.
- Centrifugeer het monster bij RT gedurende 10 minuten op 1200 x g met behulp van een benchtopcentrifuge.
OPMERKING: Bewaar het monster bij RT om verdere kristalvorming te voorkomen, omdat koelere temperaturen kristallisatie kunnen bevorderen. - Gooi het supernatant weg en was en resuspend de pellet opnieuw met 5 ml 100% ethanol. Centrifugeer het monster gedurende 10 minuten op 1200 x g bij RT met behulp van een benchtopcentrifuge.
- Gooi het supernatant weg en resuspendeer de pellet in 1 ml 100% ethanol. Bewaar het monster bij -20 °C voor latere verwerking OF bevlek het monster zoals hieronder beschreven.
OPMERKING: Er is geen significant verschil in gegevenspunten (d.w.z. deeltjesgrootte/concentratie) tussen opgeslagen of vers bevlekte monsters.
3. Nanodeeltjes tracking analyse (NTA)
- Monstervoorbereiding
- Gouden nanodeeltjes: Gebruik gouden nanodeeltjes om de instellingen op het instrument te optimaliseren. Verdun 100 nm gouden nanodeeltjes 1:1000 in ultrapure water.
- Menselijke urine: Verdun urinemonsters 20 keer in water voorafgaand aan kleuring met 5 mM Fluo-4 AM (een calciumfluorescentiekleurstof) gedurende 30 minuten in het donker. Analyseer de monsters met behulp van NTA.
- Bereid calciumoxalaatkristallen (CaOx) zoals eerder beschreven29. Verdun 10 mM stamoplossing (14,6 mg in 10 ml water) tot 50 μM in water en bevlek de verdunde monsters met 5 mM Fluo-4 AM gedurende 30 minuten in het donker voorafgaand aan de analyse.
- Calciumfosfaat (CaP) kristallen: Verdun 10 mM stamoplossing (50,4 mg in 10 ml water) tot 50 μM in water en bevlek de verdunde monsters met 5 mM Fluo-4 AM gedurende 30 minuten in het donker voorafgaand aan NTA-analyse.
- Instrumentinstellingen, camera-instellingen en gegevensverzameling
OPMERKING: De computer- en instrumentinstellingen die voor deze methode worden gebruikt, worden weergegeven in figuur 2.- Schakel de computer en vervolgens het instrument in. Open de software en zet de camera aan.
- Zodra het softwarevenster is geopend, klikt u op het opnamepictogram in de linkerbovenhoek van het venster om de opnamemodus te starten. De initialisatie van de camera duurt enkele seconden.
- Reinig het platform door er eerst lucht in te pompen met een spuit van 1 ml totdat het platform schoon lijkt. Voeg voorzichtig 2-3 keer water toe aan het apparaat met een andere spuit van 1 ml om eventuele luchtbellen te verwijderen.
OPMERKING: Zoek naar luchtbellen in het platform en in de slang. Het is belangrijk om geen bellen in het apparaat te hebben voor en tijdens het uitvoeren van monsters. Als er bellen aanwezig zijn, reinigt u het platform opnieuw met lucht en water. - Zodra het platform schoon is, voegt u water toe om te controleren op verontreiniging op het oppervlak door de camera te bekijken. Voeg vervolgens gouden nanodeeltjes toe als een controle aan de injector van de monsterlaadpomp om het instrument in te stellen.
- Pas het cameraniveau op het scherm of op de knop aan de rechterkant van het instrument aan totdat het beeld gekleurde pixels begint weer te geven en vervolgens het cameraniveau verlaagt.
- Pas vervolgens het scherm aan om de afbeelding te optimaliseren. Klik met de linkermuisknop op de videoafbeelding. Houd de linkermuisknop ingedrukt en sleep de afbeelding omhoog en omlaag om de hele weergave te krijgen.
OPMERKING: De normale cameralens en het normale filter worden gebruikt om gouden nanodeeltjes en niet-aangetaste monsters te beoordelen. - Stel de infusiesnelheid in en stel de camera zo in dat de gouden nanodeeltjes zichtbaar zijn op het camerascherm. Stel de infusiesnelheid in op hoog (d.w.z. 500 μL/min) voor de eerste installatie om ervoor te zorgen dat de gouden nanodeeltjes worden gedetecteerd. Eenmaal gedetecteerd, vermindert u de snelheid tot 50 μL/min.
- Pas het cameraniveau aan om de deeltjes te visualiseren. Voor niet-besmeurde monsters past u de schermversterking aan op niveau 5 om de camerafocus te bereiken en stelt u het cameraniveau in op 8. Zodra de scherpstelling is ingesteld, neemt u het monster op (d.w.z. slechts 1 meting gedurende 60 seconden).
OPMERKING: De scherpstelling en continue stroomsnelheid zijn belangrijk voor het verkrijgen van duidelijke en scherpe beelden van de deeltjes om te tellen. - Reinig het apparaat na optimalisatie opnieuw met water voordat u monsters beoordeelt. Bekijk de camera om er zeker van te zijn dat de slang schoon is en dat er geen deeltjes aanwezig zijn.
OPMERKING: Was de kamer tussen elk monster totdat er geen deeltjes door de camera worden gedetecteerd. - Om bevlekte monsters te analyseren, past u de camera aan op de filterpositie met het geschikte fluorescerende filter. Verdunde en bevlekte monsters op de injector van de monsterlaadpomp laden en de snelheid verlagen tot 20 μL/min voor analyse van het monster.
- Pas vervolgens de schermversterking en het cameraniveau aan, omdat dit belangrijke parameters zijn. Stel voor gebeitst (fluorescerend) monsters de schermversterking in op 5 en het cameraniveau op niveau 13.
OPMERKING: Deze parameters variëren afhankelijk van het type monster en elk monster moet worden geoptimaliseerd om focus te krijgen. - Gebruik standaardmeting om de monsters te meten voor 5 vangsten per monster waarbij één opnameduur 60 seconden duurt.
- Sla gegevens op na elke meting en sla deze op. De software slaat beeld- en videobestanden op voor elke meting. De software biedt uitvoergegevens (bijv. kristalgrootte: 10 nM - 1000 nM en concentratie) in zowel Excel- als PDF-indelingen.
- Bereken het gemiddelde aantal nanodeeltjes voor alle 5 metingen voor elk afzonderlijk monster. Analyseer de gegevens met behulp van standaarddeviatie of standaardfout van het gemiddelde en gebruik t-tests voor gekoppelde analyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De bevindingen van deze studie tonen aan dat NTA efficiënt de gemiddelde grootte en concentratie van calcium kan detecteren die urinenanokristallen in menselijke urine bevatten. Dit werd bereikt door gebruik te maken van de fluorofoor, Fluo-4 AM en nanodeeltjes tracking analyse. Fluo-4 AM was in staat om zich te binden aan zowel CaOx- als CaP-kristallen. Zoals weergegeven in figuur 3A,werden CaOx-kristallen tussen 50-270 nm groot en hebben ze een gemiddelde concentratie van 1,26 x 109 deeltjes/ml. CaP-kristallen waren tussen de 30-225 nm groot en hadden een gemiddelde concentratie van 2,22 x 109 deeltjes/ml (figuur 3B). Om te bepalen of NTA nanokristallen in menselijke urine kon beoordelen, werd gezonde volwassenen gevraagd om een gecontroleerd oxalaatdieet te consumeren, gevolgd door een hoge oxalaatbelasting. Vierentwintig uur urinemonsters voor en na de lading werden verzameld om de grootte en concentratie van de nanokristal in de urine te beoordelen. Pre-oxalaat urinemonsters bevatten enkele urine nanokristallen (1,65 x 108 ± 3,29 x 107 deeltjes/ml) tussen 110-300 nm (figuur 4). Daarentegen was er een significante toename (p<0,0001) van nanokristallen in de urine die aanwezig waren in postoxalaatmonsters (7,05 x10 8 ± 1,08 x10 8 deeltjes/ml; 100-320 nm) (figuur 4). Om de reproduceerbaarheid van de methode te bevestigen, werden de monsters driemaal gemeten en was er geen significante variatie in technische replicaties (figuur 5).
Figuur 1: Protocol voor het isoleren en kleuren van menselijke urine nanokristallen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Beschrijving van nanodeeltjesvolganalyse (NTA). (A) Computer en instrument die voor deze studies worden gebruikt. (B) Monsters worden met behulp van een spuitpomp met een continue snelheid in een inlaatslang geïnjecteerd voordat het optische oppervlak wordt gevuld. Monsters worden vervolgens waargenomen door de objectieve lens en vastgelegd door de camera terwijl monsters door het platform stromen voordat ze door de uitlaatslang gaan om te worden weggegooid. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 3: NTA detecteert Fluo-4 AM gelabelde calciumoxalaat (CaOx) en calciumfosfaat (CaP) kristallen. Representatieve grafieken van (A) CaOx en (B) CaP kristallen met grootteverdeling en concentratie. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 4: NTA detecteert Fluo-4 AM gelabelde 24-uurs menselijke urinaire nanokristallen. Representatieve grafiek van Fluo-4 AM gelabelde urine nanokristallen in 24-uurs pre-oxalaat en post-oxalaat monsters van een gezonde volwassene op een gecontroleerd oxalaat dieet. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 5: Technische replica's van menselijke nanokristallen in 24-uurs urineverzamelingen met behulp van NTA. Technische replica's van Fluo-4 AM gelabelde urine nanokristallen in 24-uurs (A) pre-oxalaat en (B) post-oxalaat monsters van een gezonde volwassene op een gecontroleerd oxalaat dieet. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
NTA is in deze studie gebruikt om nanokristallen in menselijke urine te beoordelen met behulp van een calciumbindende sonde, Fluo-4 AM. Er is geen standaardmethode beschikbaar om nanokristallen in de urine te detecteren. Sommige onderzoeksgroepen hebben nanokristallen in de urine gedetecteerd en vertrouwden op het gebruik van uitgebreide protocollen of methoden die beperkt zijn in hun vermogen om de monsters te kwantificeren27,28. Deze studie toont een specifieke en gevoelige methode voor het detecteren van calcium dat nanokristallen bevat in de urine van mensen die deelnamen aan een dieetvoedingsstudie die bestond uit het innemen van een hoge oxalaatbelasting. De hoeveelheid geconsumeerd oxalaat was gelijk aan de werkelijke consumptie van oxalaat (bijv. 1/2 spinaziesalade).
NTA is een goed gekarakteriseerd hulpmiddel met hoge resolutie dat Browniaanse beweging gebruikt om deeltjes in oplossing30te meten. Het is gebruikt voor de beoordeling van biologische nanodeeltjes in een verscheidenheid van biologische monsters31,32,33. Bovendien kan NTA de grootte en concentratie van deeltjes in elk type biologisch monster nauwkeurig voorspellen. Voor deze methode is geen etikettering vereist. etikettering kan echter worden gebruikt om specifieke deeltjes te detecteren. Fluo-4 AM werd in deze studie gebruikt om calcium met nanokristallen in urinemonsters efficiënt en specifiek te detecteren. Calcium fluorescerende sondes werden aanvankelijk gebruikt om vrij cytosolisch calcium te meten34. Fluo-4 is een analoog van Fluo-3 waarvan de fluorescentie > 100 keer toeneemt bij binding aan vrij calcium35. Bovendien is aangetoond dat Fluo-4 calciumdeeltjes in de synoviale vloeistof van patiënten met artritis beoordeelt met behulp van flowcytometrie36. Daarom gebruikten we Fluo-4 AM voor deze studies.
Alle monsters werden continu in het platform geïnjecteerd voor nauwkeurige detectie. Het bepalen van de concentratie en deeltjesgrootte hangt af van het debiet, aangezien een hoog debiet (d.w.z. 50 μL/min) van invloed kan zijn op een nauwkeurige beoordeling van de concentratie, evenals de deeltjesgrootte in vergelijking met een statische instelling en een lager debiet (d.w.z. 20 μL/min)37. Een constant langzaam debiet zorgt dus voor een nauwkeurige meting van het aantal deeltjes dat in monsters aanwezig is. Andere belangrijke parameters die van invloed kunnen zijn op het aantal deeltjes en de grootte zijn het cameraniveau, de detectiedrempel en de scherpstelling38,39,40. Een consistente deeltjesmeting in monsters (CV ca. 20%) werd waargenomen in de huidige studie, die consistent was met bevindingen uit een andere studie39. Ten slotte is de aanwezigheid van nanokristallen in menselijke urine bevestigd met behulp van elektronenmicroscopie29. Dit onderzoek toont aan dat NTA met succes nanokristallen van mensen kan meten.
Een voordeel van dit protocol is het gebruik van Fluo-4 AM om calciumhoudende deeltjes in oplossing te evalueren. Een ander voordeel is de minimale variabiliteit die wordt waargenomen bij het detecteren van nanokristallen in monsters. Een beperking van NTA in deze instelling is het onvermogen om de morfologie van nanokristallen te onderscheiden. Deze methode kan echter nuttig zijn om kristallurie te detecteren voor het voorspellen van het steenrisico bij personen met een geschiedenis van calciumhoudende nierstenen. Dit protocol kan de huidige methodologieën niet vervangen, maar kan wel nieuw inzicht geven in nanokristallen in de urine. Het gebruik van NTA om calciumhoudende kristallen in de urine te beoordelen is een nieuwe benadering die het belang van nanokristallijne moet benadrukken die verder gaat dan standaardmicroscopie en bovengenoemde methoden. Aanvullende onderzoeken zijn gerechtvaardigd om de betrouwbaarheid van deze methode in de niersteenpopulatie te onderzoeken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren geen belangenconflicten.
Acknowledgments
De auteurs bedanken alle deelnemers aan de studie en de UAB CCTS Bionutrition Core en UAB High Resolution Imaging Service Center voor hun bijdragen. Dit werk werd ondersteund door NIH-subsidies DK106284 en DK123542 (TM) en UL1TR003096 (National Center for Advancing Translational Sciences).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Benchtop Centrifuge | Jouan Centrifuge | CR3-12 | |
| Calcium Oxalate monohydrate | Synthesized in the lab as previously described29. | Store at RT; Stock 10 mM | |
| Calcium Phosphate crystals (hydroxyapatite nanopowder) | Sigma | 677418 | Store at RT; Stock 10 mM |
| Ethanol | Fischer Scientific | AC615095000 | Store at RT; Stock 100% |
| Fluo-4 AM* | AAT Bioquest, Inc. | 20550 | Store at Freezer (-20°C); Stock 5 mM |
| Gold Nanoparticles | Sigma | 742031 | Store at 2-8°C |
| NanoSight Instrument | Malvern Instruments, UK | NS300 | |
| Syringe pump | Harvard Apparatus | 98-4730 | |
| Virkon Disinfectant | LanXESS Energizing Company, Germany | LSP | |
| *Fluorescence dyes are light sensitive; stock and aliquots should be stored in the dark at -20°C. |
References
- Fogazzi, G. B. Crystalluria: a neglected aspect of urinary sediment analysis. Nephrology, Dialysis, Transplantation. 11 (2), 379-387 (1996).
- Kuo, R. L. Urine calcium and volume predict coverage of renal papilla by Randall's plaque. Kidney International. 64 (6), 2150-2154 (2003).
- Robertson, W. G., Peacock, M., Nordin, B. E. Calcium crystalluria in recurrent renal-stone formers. Lancet. 2 (7610), 21-24 (1969).
- Robertson, W. G., Peacock, M. Calcium oxalate crystalluria and inhibitors of crystallization in recurrent renal stone-formers. Clinical Science. 43 (4), 499-506 (1972).
- Hallson, P. C., Rose, G. A. A new urinary test for stone "activity". British Journal of Urology. 50 (7), 442-448 (1978).
- Daudon, M., Hennequin, C., Boujelben, G., Lacour, B., Jungers, P. Serial crystalluria determination and the risk of recurrence in calcium stone formers. Kidney International. 67 (5), 1934-1943 (2005).
- Baumann, J. M., Affolter, B. From crystalluria to kidney stones, some physicochemical aspects of calcium nephrolithiasis. World Journal of Nephrology. 3 (4), 256-267 (2014).
- Patel, M., et al. Oxalate induces mitochondrial dysfunction and disrupts redox homeostasis in a human monocyte derived cell line. Redox Biology. 15, 207-215 (2018).
- Khan, S. R. Role of renal epithelial cells in the initiation of calcium oxalate stones. Nephron Experimental Nephrology. 98 (2), 55-60 (2004).
- Mulay, S. R., et al. Calcium oxalate crystals induce renal inflammation by NLRP3-mediated IL-1beta secretion. Journal of Clinical Investigation. 123 (1), 236-246 (2013).
- Umekawa, T., Chegini, N., Khan, S. R. Oxalate ions and calcium oxalate crystals stimulate MCP-1 expression by renal epithelial cells. Kidney International. 61 (1), 105-112 (2002).
- Huang, M. Y., Chaturvedi, L. S., Koul, S., Koul, H. K. Oxalate stimulates IL-6 production in HK-2 cells, a line of human renal proximal tubular epithelial cells. Kidney International. 68 (2), 497-503 (2005).
- Lu, X. Renal tubular epithelial cell injury, apoptosis and inflammation are involved in melamine-related kidney stone formation. Urological Research. 40 (6), 717-723 (2012).
- Williams, J., Holmes, R. P., Assimos, D. G., Mitchell, T. Monocyte Mitochondrial Function in Calcium Oxalate Stone Formers. Urology. 93, 221-226 (2016).
- Balcke, P., et al. Transient hyperoxaluria after ingestion of chocolate as a high risk factor for calcium oxalate calculi. Nephron. 51 (1), 32-34 (1989).
- Khan, S. R., Kok, D. J.
- Rodgers, A., Allie-Hamdulay, S., Jackson, G. Therapeutic action of citrate in urolithiasis explained by chemical speciation: increase in pH is the determinant factor. Nephrology, Dialysis, Transplantation. 21 (2), 361-369 (2006).
- Verplaetse, H., Verbeeck, R. M., Minnaert, H., Oosterlinck, W. Solubility of inorganic kidney stone components in the presence of acid-base sensitive complexing agents. European Urology. 11 (1), 44-51 (1985).
- Frochot, V., Daudon, M. Clinical value of crystalluria and quantitative morphoconstitutional analysis of urinary calculi. International Journal of Surgery. 36, London, England. Pt D 624-632 (2016).
- Grover, P. K., Thurgood, L. A., Wang, T., Ryall, R. L. The effects of intracrystalline and surface-bound proteins on the attachment of calcium oxalate monohydrate crystals to renal cells in undiluted human urine. BJU International. 105, 708-715 (2010).
- Bader, C. A., Chevalier, A., Hennequin, C., Jungers, P., Daudon, M. Methodological aspects of spontaneous crystalluria studies in calcium stone formers. Scanning Microscopy. 8 (2), 215-231 (1994).
- Daudon, M., Cohen-Solal, F., Jungers, P. Eurolithiasis. 9th European Symposium on Urolithiasis. , Shaker Publishing. Maastricht. 261-263 (2001).
- Werness, P. G., Bergert, J. H., Smith, L. H.
- Fan, J., Chandhoke, P. S. Examination of crystalluria in freshly voided urines of recurrent calcium stone formers and normal individuals using a new filter technique. Journal of Urology. 161 (5), 1685-1688 (1999).
- Sun, X. Y., Ouyang, J. M., Yu, K. Shape-dependent cellular toxicity on renal epithelial cells and stone risk of calcium oxalate dihydrate crystals. Scientific Reports. 7 (1), 7250 (2017).
- He, J. Y., Deng, S. P., Ouyang, J. M. Morphology, particle size distribution, aggregation, and crystal phase of nanocrystallites in the urine of healthy persons and lithogenic patients. IEEE Trans Nanobioscience. 9 (2), 156-163 (2010).
- Gao, J., et al. Comparison of Physicochemical Properties of Nano- and Microsized Crystals in the Urine of Calcium Oxalate Stone Patients and Control Subjects. Journal of Nanomaterials. 2014, 9 (2014).
- Gavin, C. T., et al. Novel Methods of Determining Urinary Calculi Composition: Petrographic Thin Sectioning of Calculi and Nanoscale Flow Cytometry Urinalysis. Scientific Reports. 6, 19328 (2016).
- Kumar, P., et al. Dietary Oxalate Induces Urinary Nanocrystals in Humans. Kidney International Reports. 5 (7), 1040-1051 (2020).
- Carr, B., Hole, P., Malloy, A., Nelson, P., Smith, J. Applications of nanoparticle tracking analysis in nanoparticle research--A mini-review. European Journal of Parenteral Sciences and Pharmaceutical Sciences. 14 (2), 45 (2009).
- Dragovic, R. A., et al. Sizing and phenotyping of cellular vesicles using Nanoparticle Tracking Analysis. Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, and Medicine. 7 (6), 780-788 (2011).
- Dragovic, R. A., et al. Isolation of syncytiotrophoblast microvesicles and exosomes and their characterisation by multicolour flow cytometry and fluorescence Nanoparticle Tracking Analysis. Methods. 87, 64-74 (2015).
- Gercel-Taylor, C., Atay, S., Tullis, R. H., Kesimer, M., Taylor, D. D. Nanoparticle analysis of circulating cell-derived vesicles in ovarian cancer patients. Analytical Biochemistry. 428 (1), 44-53 (2012).
- Minta, A., Kao, J. P., Tsien, R. Y. Fluorescent indicators for cytosolic calcium based on rhodamine and fluorescein chromophores. Journal of Biological Chemistry. 264 (14), 8171-8178 (1989).
- Harkins, A. B., Kurebayashi, N., Baylor, S. M. Resting myoplasmic free calcium in frog skeletal muscle fibers estimated with fluo-3. Biophysical Journal. 65 (2), 865-881 (1993).
- Hernandez-Santana, A., Yavorskyy, A., Loughran, S. T., McCarthy, G. M., McMahon, G. P. New approaches in the detection of calcium-containing microcrystals in synovial fluid. Bioanalysis. 3 (10), 1085-1091 (2011).
- Tong, M., Brown, O. S., Stone, P. R., Cree, L. M., Chamley, L. W. Flow speed alters the apparent size and concentration of particles measured using NanoSight nanoparticle tracking analysis. Placenta. 38, 29-32 (2016).
- Maas, S. L., et al. Possibilities and limitations of current technologies for quantification of biological extracellular vesicles and synthetic mimics. Journal of Controlled Release. 200, 87-96 (2015).
- Hole, P., et al. Interlaboratory comparison of size measurements on nanoparticles using nanoparticle tracking analysis (NTA). Journal of Nanoparticle Research. 15, 2101 (2013).
- Tomlinson, P. R., et al. Identification of distinct circulating exosomes in Parkinson's disease. Annals of Clinical and Translational Neurology. 2 (4), 353-361 (2015).
