תיוג כפול immunofluorescence באמצעות נוגדנים מאותו המין כדי לחקור אינטראקציות מארח-פתוגן
Summary
כאן, הפרוטוקול מתאר כיצד לבצע תיוג כפול immunofluorescence באמצעות נוגדנים ראשוניים שגדלו באותו מין כדי לחקור אינטראקציות מארח-פתוגן. כמו כן, הוא יכול לכלול את הנוגדן השלישי ממארח אחר בפרוטוקול זה. גישה זו יכולה להתבצע בכל סוג תא ופתוגנים.
Abstract
כיום, ניתן למצוא מגוון רחב של כלים מולקולריים הזמינים לחקר אינטראקציות תא טפיל-מארח. עם זאת, קיימות מגבלות מסוימות כדי להשיג נוגדנים חד שבטיים או פוליקלונליים מסחריים המזהים מבני תאים וחלבונים ספציפיים בטפילים. חוץ מזה, יש כמה נוגדנים מסחריים זמינים לתייג טריפנוסומטידים. בדרך כלל, נוגדנים פוליקלונליים נגד טפילים מוכנים בתוך הבית ויכולים להיות מאתגרים יותר לשימוש בשילוב עם נוגדנים אחרים המיוצרים באותו מין. כאן, הפרוטוקול מדגים כיצד להשתמש בנוגדנים פוליקלונליים ומונו-שבטיים שגדלו באותו מין כדי לבצע תיוג כפול immunofluorescence לחקור אינטראקציות תא מארח ופתוגן. כדי להשיג את התיוג הכפול immunofluorescence, זה חיוני כדי לדגור תחילה את הנוגדן הפוליקלונלי עכבר ולאחר מכן בצע את הדגירה עם העכבר המשני IgG נוגדן מצומד לכל פלואורוכרום. לאחר מכן, יש צורך בצעד חסימה נוסף כדי למנוע כל זכר לנוגדן העיקרי להיות מוכר על ידי הנוגדן המשני הבא. לאחר מכן, נוגדן מונוקלונלי של עכבר ונוגדן המשני הספציפי של IgG התת-מחלקה שלו מצומדים לפלורוכרום שונה מתווספים לדגימה בזמנים המתאימים. בנוסף, ניתן לבצע תיוג משולש immunofluorescence באמצעות נוגדן שלישי שגדל במין אחר. כמו כן, מבנים כגון גרעינים ו actin יכול להיות מוכתם לאחר מכן עם תרכובות ספציפיות שלהם או תוויות. לכן, גישות אלה המוצגות כאן ניתן להתאים עבור כל תא שמקורות הנוגדנים העיקריים שלו מוגבלים.
Introduction
כדי לחקור את האינטראקציה של הפתוגן עם התא המארח ברמה התאית מספק מידע חיוני על הגורמים הבסיסיים של המחלה מאז קבוצות שונות, כגון וירוסים, חיידקים, פרוטוזואה, יכול להדביק את רוב סוגי התא המארח1,2,3,4. זה יכול גם לעזור לפתח ולזהות מטרות טיפוליות פוטנציאליות שיכולות להאט או לעכב את הצמיחה של הפתוגן. בתנאים חיים, הנוגדנים המיוצרים אחראים לזיהוי רכיבים עצמיים, אנטיגנים מווירוסים, רכיבים או מוצרים חיידקיים, פטריות, טפילים ואחרים5.
לשם כך, נוגדנים הם כלים בשימוש נרחב, בעיקר להבנת המיקום והתפקוד של מבנים וחלבונים תאיים. מספר מחקרים באמצעות תיוג נוגדנים מרובים מדגימים כי צעדי חסימה נוספים תורמים לספציפיות של האימונולוקליזציה. בנוסף, רוב הפרוטוקולים המתוארים משתמשים בנוגדנים חד שבטיים מסחריים ספציפיים, כולל נוגדנים מאותו מין מארח6,7,8,9,10,10,11,12,13,14.
בדרך כלל, תיוג כפול immunofluorescence משתמש בשני נוגדנים שגדלו במינים שונים כדי להכתים את מבני התא של עניין או את הפתוגנים ואת התאים המארחים כדי לראות את האינטראקציה ביניהם. עם זאת, זו יכולה להיות בעיה כאשר אין נוגדנים חד שבטיים או פוליקלונליים מסחריים ספציפיים עבור פתוגנים מסוימים זמינים לביצוע התיוג הכפול. כמו כן, ישנן ערכות הטיות נוגדנים זמינות מסחרית, וניתן להטות את הנוגדנים העיקריים ישירות לפלואורופור על ידי תגובת אסתר סוצ’ינימידיל15. הבעיה היא כי ערכות אלה הם לעתים קרובות יקרים, ויש צורך מספיק נוגדנים כדי לתייג אותם. בידיעה זו, פיתחנו בהצלחה שיטה אימונופלואורסצנטית כפולה באמצעות שני נוגדנים שונים שגדלו באותו מין כדי לחקור לוקליזציה של חלבון ב– Trypanosoma brucei16. עם זאת, עבור טפילים תאיים, כולל טריפנוסומה קרוזי, גישה זו לא הודגמה. כאן, אנו מראים כיצד לבצע תיוג כפול immunofluoreorescence ללמוד טפילים תאיים T. cruzi ואת התא המארח באמצעות נוגדנים ראשוניים שגדלו באותו המין ללא תגובות צולבות. מלבד שיטה זו, תיוג אימונופלואורסצנטי משולש הוקם עם הוספת הנוגדן השלישי ממין אחר. גישות אלה מסייעות כאשר מקור הנוגדנים מוגבל וניתן להשתמש בהן בכל סוג תא.
Protocol
Representative Results
Discussion
כאן, אנו מציגים פרוטוקול לביצוע חיסונים כפולים בתאים נגועים טריפנוסומה קרוזי באמצעות שני נוגדנים שונים מאותו מין מארח. כדי ללמוד, בפירוט רב יותר, את ההשלכות של הזיהום, מבנים בתא המארח כגון הגרעין או אברונים ציטוטוסוליים ניתן לתייג באמצעות פרוטוקול זה. כמו כן, ניתן להשתמש בו בשיטת התוו…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP 2010/19547-1; 2018/03677-5) to MMAB, by Fundação de Apoio ao Ensino, Pesquisa e Assistência- FAEPA to MMAB and by Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior- Brasil (CAPES) – קוד פיננסי 001. CG-C קיבל מלגת תואר שני ודוקטורט מ- CAPES ו- LAMT-S קיבל מלגת דוקטורט מ- CNPq. אנו מודים לאליזבטה ר. מילאני על הסיוע במיקרוסקופיה קונפוקלית וד”ר דריו זמבוני על אספקת תאי LLC-MK2 (בית הספר לרפואה ריבייראו פרטו, USP).
Materials
| Alexa Fluor 488 – IgG2b antibody | Life technologies, USA | A21141 | Goat anti-mouse |
| AffiniPure Rabbit anti-mouse IgG (H+L) | Jackson Immunoresearch, USA | 315-005-003 | Anti-mouse antibody |
| Alexa Fluor 488 – IgG F (ab')2 (H+L) antibody | Life technologies, USA | A11017 | Goat anti mouse |
| Alexa Fluor 594 IgG1 antibody | Life technologies, USA | A21125 | Goat anti-mouse |
| Alexa Fluor 647 – IgG F (ab')2 (H+L) antibody | Life technologies, USA | A21237 | Goat anti-mouse |
| Anti-hnRNPA1 antibody IgG2b | Sigma-Aldrich, USA | R4528 | Mouse antibody |
| anti-TcFAZ (T. cruzi FAZ protein) antibody | Our lab | In-house | Mouse antibody |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich, USA | A2153-10G | Albumin protein |
| Detergent Igepal CA-630 | Sigma-Aldrich, USA | I3021 | Nonionic Detergent |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco, Thermo fisher scientific, USA | 12657-029 | Serum |
| Penicillin Streptomycin | Gibco, Thermo fisher scientific, USA | 15140-122 | Antibiotic |
| Phalloidin Alexa Fluor 594 | Life technologies, USA | A12381 | Actin marker |
| ProLong Gold antifade with DAPI | Life technologies, USA | P36935 | Mounting media reagent |
| RPMI 1640 1X with L-glutamine | Corning, USA | 10-040-CV | Cell culture media |
| Trypsin-EDTA solution | Sigma-Aldrich, USA | T4049-100ML | Bioreagent |
References
- Lloyd, R. E. Nuclear proteins hijacked by mammalian cytoplasmic plus strand RNA viruses. Virology. 479-480, 457-474 (2015).
- Casadevall, A., Pirofski, L. A. Host-pathogen interactions: basic concepts of microbial commensalism, colonization, infection, and disease. Infection and Immunity. 68 (12), 6511-6518 (2000).
- Sidik, S. M., Salsman, J., Dellaire, G., Rohde, J. R. Shigella infection interferes with SUMOylation and increases PML-NB number. PLoS One. 10 (4), 0122585 (2015).
- Robert McMaster, W., Morrison, C. J., Kobor, M. S. Epigenetics: A New Model for Intracellular Parasite-Host Cell Regulation. Trends in Parasitology. 32 (7), 515-521 (2016).
- Casali, P., Schettino, E. W. Structure and function of natural antibodies. Current Topics in Microbiology and Immunology. 210, 167-179 (1996).
- Ansorg, A., Bornkessel, K., Witte, O. W., Urbach, A. Immunohisto-chemistry and multiple labeling with antibodies from the same host species to study adult hippocampal neurogenesis. Journal of Visualized Experiments. (98), e52551 (2015).
- Tóth, Z. E., Mezey, E. Simultaneous visualization of multi-ple antigens with tyramide signal amplification using antibodies from the same species. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 55 (6), 545 (2007).
- Ma, B., Winkelbach, S., Lindenmaier, W., Dittmar, K. E. Six-colour fluorescent imaging of lymphoid tissue based on colour addition theory. Acta Histochemica. 108 (4), 243 (2006).
- Buchwalow, I. B., Minin, E. A., Boecker, W. A multicolor fluorescence immunostaining technique for simultaneous antigen targeting. Acta Histochemica. 107 (2), 143 (2005).
- Nakamura, A., Uchihara, T. Dual enhancement of triple immunofluorescence using two antibodies from the same species. Journal of Neuroscience Methods. 135 (1-2), 67 (2004).
- McCormick, J., Lim, I., Nichols, R. Neuropeptide precursor pro-cessing detected by triple immunolabeling. Cell and Tissue Research. 297 (2), 197 (1999).
- Shindler, K. S., Roth, K. A. Double immunofluorescent staining using two unconjugated primary antisera raised in the same species. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 44 (11), 1331 (1996).
- Wang, B. L., Larsson, L. I. Simultaneous demonstration of multiple anti-gens by indirect immunofluorescence or immunogold staining. Novel light and electron microscopical double and triple staining method employing primary antibodies from the same species. Histochemistry. 83 (1), 47 (1985).
- Lewis Carl, S. A., Gillete-Ferguson, I., Ferguson, D. G. An indirect immunofluorescence procedure for staining the same cryosection with two mouse monoclonal primary antibodies. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 41 (8), 1273-1278 (1993).
- Pranchevicius, M. C., et al. Myosin Va phosphorylated on Ser1650 is found in nuclear speckles and redistributes to nucleoli upon inhibition of transcription. Cell Motility and the Cytoskeleton. 65 (6), 441-456 (2008).
- Moreira, B. P., de Castro, C. G., Prado, L. C. d. S., da Fonseca, C. K., Baqui, M. M. A., Méndez-Vilas, A. Use of antibodies from the same host species in double labeling immunofluorescence on trypanosome cytoskeleton. Microscopy and Imaging Science: Practical Approaches to Applied Research and Education. 7, 374-378 (2016).
- Hull, R. N., Cherry, W. R., Tritch, O. J. Growth characteristics of monkey kidney cell strains LLC-MK1, LLC-MK2, and LLC-MK2 (NCTC-3196) and their utility in virus research. Journal of Experimental Medicine. 115, 903-918 (1962).
- Stecconi-Silva, R. B., Andreoli, W. K., Mortara, R. A. Parameters affecting cellular invasion and escape from the parasitophorous vacuole by different infective forms of Trypanosoma cruzi. Memórias do Instituto Oswaldo Cruz. 98 (7), 953-958 (2003).
- de Souza, W., de Carvalho, T. M., Barrias, E. S. Review on Trypanosoma cruzi: Host Cell Interaction. International Journal of Cell Biology. 2010, 295394 (2010).
- Burleigh, B. A., Woolsey, A. M. Cell signalling and Trypanosoma cruzi invasion. Cellular Microbiology. 4 (11), 701-711 (2002).
- Baqui, M. M. A., Takata, C. S., Milder, R. V., Pudles, J. A giant protein associated with the anterior pole of a trypanosomatid cell body skeleton. European Journal of Cell Biology. 70, 243-249 (1996).
- Baqui, M. M., Milder, R., Mortara, R. A., Pudles, J. In vivo and in vitro phosphorylation and subcellular localization of trypanosomatid cytoskeletal giant proteins. Cell Motility and the Cytoskeleton. 47 (1), 25-37 (2000).
- Baqui, M. M., De Moraes, N., Milder, R. V., Pudles, J. A giant phosphoprotein localized at the spongiome region of Crithidia luciliae thermophila. Journal of Eukaryotic Microbiology. 47 (6), 532-537 (2000).
- Jean-Philippe, J., Paz, S., Caputi, M. hnRNP A1: the Swiss army knife of gene expression. International Journal of Molecular Sciences. 14 (9), 18999-19024 (2013).
- Vidarsson, G., Dekkers, G., Rispens, T. IgG subclasses and allotypes: from structure to effector functions. Frontiers in Immunology. 5, 520 (2014).
