Deniz Örneklerinde Toplam Lipid ve Lipid Sınıflarının Belirlenmesi
Summary
Bu protokol deniz suyu ve biyolojik örneklerde lipitlerin belirlenmesi içindir. Filtratlardaki lipitler, katı madde durumunda kloroform veya kloroform ve metanol karışımları ile çıkarılır. Lipid sınıfları, alev iyonizasyon tespiti ile çubuk ince katmanlı kromatografi ile ölçülür ve toplam lipit içeriği verir.
Abstract
Lipitler büyük ölçüde karbon ve hidrojenden oluşur ve bu nedenle dendeki diğer organik makromoleküllerden daha fazla spesifik enerji sağlar. Karbon ve hidrojen bakımından zengin olmaları aynı zamanda hidrofobiktir ve organik kirleticiler için bir çözücü ve emilim taşıyıcısı olarak işlev görür ve böylece deniz ekosistemlerinde kirletici biyoakümülasyonun sürücüleri olabilir. Hidrofobik doğaları deniz suyundan veya biyolojik örneklerden izolasyonlarını kolaylaştırır: deniz lipit analizi, kutupsal olmayan organik çözücülerde örnekleme ve daha sonra ekstraksiyon ile başlar ve su matrislerindeki diğer maddelerden ayrılmaları için uygun bir yöntem sağlar.
Deniz suyu örneklenmişse, ilk adım genellikle filtrasyon yoluyla operasyonel olarak tanımlanmış ‘çözünmüş’ ve ‘partikül’ fraksiyonlara ayrılmayı içerir. Numuneler toplanır ve lipitler tipik olarak gerçekten çözünmüş madde ve kolloidler için kloroform ve katı maddeler ve biyolojik örnekler için kloroform ve metanol karışımları ile numune matrisinden izole edilir. Bu tür özler biyojenik ve antropojenik kaynaklardan birkaç sınıf içerebilir. Şu anda total lipitler ve lipit sınıfları belirlenebilir. Total lipid, geleneksel olarak kromatografik olarak ayrılmış olan ayrı ayrı belirlenmiş lipit sınıflarının toplanabilir. Deniz örneklerinden elde edilen lipitlerin nicel analizi için alev iyonizasyon algılamalı (FID) ince katmanlı kromatografi (TLC) düzenli olarak kullanılmaktadır. TLC-FID, sinoptik lipid sınıfı bilgilerini ve sınıfları özetleyerek toplam lipid ölçümünü sunmaktadır.
Lipid sınıfı bilgileri, lipid özlerinden salındıktan sonra, yağ asitleri ve / veya steroller gibi bireysel bileşenlerin ölçümleriyle birleştirildiğinde özellikle yararlıdır. Çok çeşitli lipit yapıları ve işlevleri, ekosistem sağlığını ve antropojenik etkilerin etki derecesini değerlendiren ekolojik ve biyojeokimyasal araştırmalarda yaygın olarak kullanıldığı anlamına gelir. Deniz faunasına (örneğin, aquafeeds ve/veya av) diyet değerine sahip maddeleri ölçmek ve su kalitesinin bir göstergesi olarak (örneğin, hidrokarbonlar) istihdam edilmiştir.
Introduction
Burada açıklanan yöntemler, operasyonel olarak deniz lipitleri olarak tanımlanan maddelerle ilgilidir. Bu tanım, polar olmayan organik çözücülerde sıvı-sıvı ekstraksiyonuna uygun olmalarına dayanır ve su matrislerindeki diğer maddelerden ayrılmaları için uygun bir yöntem sağlar. Hidrofobik doğaları, deniz suyundan veya biyolojik örneklerden izole edilmelerini, zenginleşmelerini ve tuz ve proteinlerin uzaklaştırılmasını kolaylaştırır.
Lipit içeriğinin ve deniz organizmalarındaki bileşiminin ölçülmesi, on yıllardır gıda ağı ekolojisi, su ürünleri beslenmesi ve gıda biliminde büyük ilgi çekmektedir. Lipitler, canlı organizmalarda evrensel bileşenlerdir, hücre zarlarında temel moleküller olarak hareket eder, biyoyararlanımlı enerjinin ana kaynakları olarak, ısı yalıtımı ve yüzdürme sağlar ve sinyal molekülleri olarak hizmet eder. Diğer alanlarda lipit belirleme prosedürleri iyi tanımlanmış olsa da, deniz örnekleriyle kullanımları genellikle alan koşullarına ve örnek tip1’euyum sağlamak için değişiklik gerektirir.
Deniz suyu numuneleri için, ilk adım genellikle normalde filtrasyon yoluyla operasyonel olarak tanımlanmış ‘çözünmüş’ ve ‘partikül’ fraksiyonlara ayrılmayı gerektirir (Protokol adım 1). Partikül fraksiyonu filtre tarafından tutulan şeydir ve gözeneklerin boyutu kesme2’yitanımlamada önemlidir. Genellikle partikül madde örneklemesi yaparken, lipit konsantrasyonlarını toplam kütle konsantrasyonlarıyla ilişkilendirmek isteriz, bu durumda bu amaç için ayrı, daha küçük, örnek (örneğin, 10 mL) alınmalıdır (Protokol adım 1, not). Doğru bir kütle tayini elde etmek için filtrasyonun sonuna amonyum format (35 g/L) eklemek önemlidir.
Daha büyük numuneden elde edilen deniz suyu filtratı, numune tipine bağlı olarak 250 mL ile 1 L arasında olmalıdır ve ayrık bir hunide sıvı-sıvı ekstraksiyona tabi tutulur (Protokol adım 2). Lipitlerin hidrofobik doğası, kloroform gibi kutupsal olmayan bir çözücüde ekstraksiyon ile diğer bileşiklerden ayrılabilecekleri anlamına gelir. Suda çözünür bileşenler sulu tabakada kalırken lipitlerin organik tabakaya bölündüğü iki katmanlı bir sistem oluşturulur.
Bir filtre üzerindeki partikül numuneler veya biyolojik numuneler, kloroform içeren değiştirilmiş bir Folch ve ark. ekstraksiyonu3ile çıkarılır (Protokol adım 3). Yine, lipitlerin organik faza bölündüğü, suda çözünür moleküllerin sulu fazda kaldığı ve proteinlerin çöktüğü organik/sulu bir sistem oluşturulur. Aslında, katılar için, çoğu laboratuvar kloroform ve metanol içeren Folch ve ark. ekstraksiyon3 prosedürünün bazı varyasyonlarını kullanır. Filtreler için ilk adım 2 mL kloroform ve 1 mL metanol homojenize etmektir.
Ekstraksiyon sırasında, ester bağı hidrolizini veya karbon-karbon çift bağ oksidasyonunu azaltmak için numuneleri ve çözücüleri buz üzerinde tutarak lipitleri kimyasal veya enzimatik modifikasyondan korumaya özen edilmelidir. Dokular ve hücre lipitleri doğal antioksidanlar ve bölümlere ayırma ile oldukça iyi korunur4; bununla birlikte, örneklerin homojenizasyonunu takiben, hücre içeriği, lipitleri kimyasal veya enzimatik olarak değişime daha fazla atılır. Çoğu sterol gibi bazı lipitler çok kararlıdır, çoklu doymamış yağ asitleri içerenler gibi diğerleri ise kimyasal oksidasyona daha duyarlıdır. Konjuge çift bağlı steroller gibi diğerleri, ışık5ile katalİze edilen oksidasyona eğilimlidir. Ekstraksiyonlardan sonra, lipitler kimyasal oksidasyona karşı çok daha hassastır ve numuneler azot gibi inert bir gaz altında saklanmalıdır. Özleri konsantre etmek için yumuşak bir azot akışı da kullanılır.
Konsantrasyondan sonra, lipitler normalde karbonhidrat ve proteinlerin kJ / g’sinden daha fazla, yüksek konsantrasyonda enerji sağlayan deniz ekosistemlerinin önemli bir bileşeni oldukları için toplu olarak ölçülür. Her zaman bireysel bileşenler olarak ölçülecektir: lipitlerin kapsamlı analizi genellikle kimyasal doğalarına göre daha basit kategorilere ayrılmayı içerir. Bu nedenle, tam bir analiz toplam lipitlerin, lipit sınıflarının ve bireysel bileşiklerin ölçülmesini içerir.
Total lipit, kromatografi ile ayrılmış bireysel ölçülen lipit sınıflarının toplamı alınarak belirlenebilir6. Bir deniz lipit özü biyojenik ve antropojenik kaynaklardan bir düzineden fazla sınıf içerebilir. Lipid yapılarının çok çeşitliliği, yapıların bireysel gruplandırmalarının belirlenmesiyle çok fazla bilgi kazanılması anlamına gelir. Lipid sınıfları bireysel olarak veya belirli gruplarda, belirli organizma türlerinin varlığının yanı sıra fizyolojik durumlarını ve aktivitelerini belirtmek için kullanılmıştır2. Ayrıca, çözünmüş organik madde (DOM) ve hidrofobik kirleticiler de dahil olmak üzere organik malzemenin kökenlerinin bir göstergesi olarak kullanılmıştır.
Triyasikalseroller, fosfolipidler ve steroller daha önemli biyojenik lipit sınıfları arasındadır. İlk ikisi biyokimyasal olarak ilişkilidir, çünkü iki veya üç yağ asidinin estere olduğu gliserol omurgasına sahiptirler (Şekil 1). Triacylglycerols, balmumu esterleri ile birlikte çok önemli depolama maddeleridir, diyalsikalseroller, serbest yağ asitleri ve monoacylglycerols gibi diğer yağ asidi içeren lipit sınıfları genellikle küçük bileşenlerdir. Doymamış olanlar toksik olabileceği için, canlı organizmalarda daha düşük konsantrasyonlarda serbest yağ asitleri bulunur7. Steroller (hem özgür hem de esterleşmiş formlarında) ve yağlı alkoller de daha az polar lipitler arasında yer alırken, glikolipidler ve fosfolipidler polar lipitlerdir. Polar lipitler, hücre zarlarında bulunan lipid bilayerlerinin oluşumunu sağlayan hidrofilik bir gruba sahiptir. Serbest steroller aynı zamanda membran yapısal bileşenleridir ve triyasiller oranında alındığında, yaygın olarak kullanılan bir durum veya beslenme indeksi (TAG : ST) sağlarlar8. Fosfolipidlere (ST : PL) oranla alındığında, tuza karşı bitki hassasiyetini belirtmek için kullanılabilirler: daha yüksek değerler yapısal bütünlüğü korur ve membran geçirgenliğini azaltır9. Bu oranın tersi (PL : ST) sıcaklık adaptasyonu sırasında bivalve dokularda çalışılmıştır10.
Deniz lipid sınıfları silika jel kaplı çubuklar üzerinde ince katmanlı kromatografi (TLC) ile ayrılabilir (Protokol adım 4) ve daha sonra otomatik bir FID tarayıcıda alev iyonizasyon tespiti (FID) ile tespit edilebilir ve ölçülebilir. TLC/FID, küçük örneklerden sinoptik lipit sınıfı verilerini hızla sağladığı için ve tüm sınıfların toplamını alarak, toplam lipitler için bir değer olan deniz numuneleri için rutin olarak kullanılır hale gelmiştir. TLC/FID kalite güvence (QA) değerlendirmesine tabi tutulmuştur ve tutarlı harici kalibrasyon, düşük boşluklar ve hassas çoğaltma analizi11için gerekli standartları karşılar. Değişim katsayıları (CV) veya göreli standart sapmalar% 10 civarındadır ve FID tarayıcı toplam lipid verileri normalde gravimetrik ve diğer yöntemlerle elde edilenlerin yaklaşık%90’ıdır 2. Gravimetri, FID tarayıcısının yalnızca uçucu olmayan bileşikleri ölçmesi ve ayrıca lipid olmayan malzemenin gravimetrik ölçümlere dahil edilmesinin olası bir sonucu olarak daha yüksek toplam lipitler verir.
Lipid sınıf analizi tarafından sağlanan bilgiler, özellikle yağ asitlerinin birey veya sterol veya ikisi olarak belirlenmesiyle birleştirildiğinde yararlıdır. Bu analizlere yönelik ilk adım, lipit özlerindeki sterollerle birlikte tüm bileşen yağ asitlerinin salınır (Protokol adım 5). Çok çeşitli lipit yapıları ve işlevleri, ekosistem sağlığını ve antropojenik ve karasal girdilerden ne ölçüde etkilendiklerini değerlendiren ekolojik ve biyojeokimyasal çalışmalarda geniş kullanım gördükleri anlamına gelir. Diyet değeri olan maddelerin deniz faunasına biyosentezini ölçmek ve su örneklerinin kalitesini belirtmek için kullanılmıştır. Tortu çekirdek örneklerinde lipitlerin ölçülmesi, tortuların kara-deniz marjına yakın insan arazisi kullanımındaki değişikliklere duyarlılığını göstermeye yardımcı olur.
Bireysel lipit bileşiklerini tanımlamak ve ölçmek için birincil araç geleneksel olarak FID ile gaz kromatografisi (GC) olmuştur. Ancak analizden önce, bu bileşikler türetme ile daha uçucu hale getirilir. Yağ asitleri, akil lipit sınıflarından asidik bir katalizör (H2SO4)varlığında salınır (Şekil 1). Organik kimyada, akil grubu (R-C=O) genellikle karboksilik asitten (R-COOH) türetilir. Daha sonra GC sütunlarında daha iyi ayrımlar sağlayan yağ asidi metil esterlerine (FAME) yeniden esterlenirler (Protokol adım 5).
Protocol
Representative Results
Discussion
TLC-FID sisteminin küçük örneklerden sinoptik lipid sınıfı bilgileri sağlama hızı, TLC-FID’yi daha ilgili analitik prosedürler üstlenmeden önce deniz örneklerini taramak için mümkün bir araç haline getirir. Bu tür analizler genellikle lipid özlerinden bileşen bileşiklerinin salınmasını ve gaz kromatografisi durumunda volatiliteyi artırmak için derivatizasyon gerektirir. GC-FID ile birlikte TLC-FID’nin deniz ürünleri ve diğer gıda maddelerinin özleri için güçlü bir kombinasyon olduğu b…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu araştırma, C.C. Parrish’e 105379 Kanada Doğa Bilimleri ve Mühendislik Araştırma Konseyi (NSERC) hibe numarası tarafından finanse edildi. Memorial Üniversitesi’nin Temel Araştırma Ekipmanları ve Enstrüman Eğitimi (CREAIT) Ağı bu yayının finansesine yardımcı oldu.
Materials
| 15 ml vials | VWR | 66009-560 | |
| 1-hexadecanol | Sigma | 258741-1G | |
| 1-Monopalmitoyl-rac-glycerol | Sigma | M1640-1g | |
| 2 ml vials | VWR | 46610-722 | |
| 25 mm glass fibre filters | Fisher | 09 874 32A | |
| 2ml pipet bulbs | VWR | 82024-554 | |
| 47 mm glass fibre filters | Fisher | 09 874 32 | |
| 5 3/4" pipets | Fisher | 1367820A | |
| 9" pipets | Fisher | 1367820C | |
| Acetone | VWR | CAAX0116-1 | |
| Agilent GC-FID 6890 | Agilent | ||
| Calcium Chloride ANHS 500gm | VWR | CACX0160-1 | |
| Caps for 2 ml vials | VWR | 46610-712 | |
| chloroform | VWR | CACX1054-1 | |
| Cholesteryl palmitate | Sigma | C6072-1G | |
| Chromarod S5 | Shell USA | 3252 | |
| Dichloromethane | VWR | CADX0831-1 | |
| DL-a-phosphatidylcholine, dipalmotoyl | Sigma | P5911-1g | |
| Ethyl Ether, ACS grade anhydr 4L | VWR | CAEX0190-4 | |
| Glyceryl tripalmitate | Sigma | T5888-100MG | |
| Hamilton Syringe 702SNR 25µl | Sigma | 58381 | |
| Helium | Air Liquide | A0492781 | |
| Hexane | VWR | CAHX0296-1 | |
| Hydrogen regulator | VWR | 55850-484 | |
| Iatroscan MK6 | Shell USA | ||
| Kimwipes | Fisher | 066662 | |
| Medical Air | Air Liquide | A0464563 | |
| Medium nitrile gloves | Fisher | 191301597C | |
| Nitrile gloves L | VWR | CA82013-782 | |
| Nitrogen | Air Liquide | A0464775 | |
| Nitrogen Regulator | VWR | 55850-474 | |
| Nonadecane | Sigma | 74158-1G | |
| Palmitic acid | Sigma | P0500-10G | |
| Repeating dispenser | Sigma | 20943 | |
| Sodium Bicarbonate 1kg | VWR | CA97062-460 | |
| Sodium Sulfate Anhy ACS 500gr | VWR | CA71008-804 | |
| Sulfuric acid | VWR | CASX1244-5 | |
| Teflon tape | Fisher | 14610120 | |
| tissue master 125 115V w/7mm homogenator | OMNI International | TM125-115 | |
| TLC development tank | Shell USA | 3201 | |
| UHP hydrogen | Air Liquide | A0492788 | |
| VWR solvent repippetter | VWR | 82017-766 | |
| VWR timer Flashing LED 2 channel | VWR | 89140-196 | |
| Zebron ZB-Wax GC column | Phenomenex | 7HM-G013-11 |
References
- Couturier, L. I. E., et al. State of art and best practices for fatty acid analysis in aquatic sciences. ICES Journal of Marine Science. , (2020).
- Parrish, C. C. Lipids in Marine Ecosystems. ISRN Oceanography. , 604045 (2013).
- Folch, J., Lees, M., Stanley, G. H. S. A simple method for the isolation and purification of total lipides from animal tissues. Journal of Biological Chemistry. 226, 497-509 (1957).
- Vaz, F. M., Pras-Raves, M., Bootsma, A. H., van Kampen, A. H. C. Principles and practice of lipidomics. Journal of Inherited Metabolic Disease. , (2014).
- Wolf, C., Quinn, P. J. Lipidomics: practical aspects and applications. Progress in Lipid Research. 47, 15-36 (2008).
- Parrish, C. C., Arts, M. T., ainman, B. C. Determination of total lipid, lipid classes, and fatty acids in aquatic samples. Lipids in Freshwater Ecosystems. , 4-20 (1999).
- Jüttner, F. Liberation of 5,8,11,14,17-eicosapentaenoic acid and other polyunsaturated fatty acids from lipids as a grazer defense reaction in epilithic diatom biofilms. Journal of Phycology. 37, 744-755 (2001).
- Carreón-Palau, L., Parrish, C. C., Pérez-España, H., Aguiñiga-Garcia, S. Elemental ratios and lipid classes in a coral reef food web under river influence. Progress in Oceanography. 164, 1-11 (2018).
- Maciel, E., et al. Bioprospecting of marine macrophytes using MS-based lipidomics as a new approach. Marine Drugs. 14, 49 (2016).
- Pernet, F., Tremblay, R., Comeau, L., Guderley, H. Temperature adaptation in two bivalve species from different thermal habitats: energetics and remodelling of membrane lipids. Journal of Experimental Biology. 210, 2999-3014 (2007).
- Bergen, B. J., Quinn, J. G., Parrish, C. C. Quality-assurance study of marine lipid-class determination using Chromarod/Iatroscan thin-layer chromatography-flame ionization detector. Environmental Toxicology and Chemistry. 19, 2189-2197 (2000).
- Foroutani, B. M., Parrish, C. C., Wells, J., Taylor, R. G., Rise, M. L. Minimizing marine ingredients in diets of farmed Atlantic salmon (Salmo salar): effects on liver and head kidney lipid class, fatty acid and elemental composition. Fish Physiology & Biochemistry. 46, 2331-2353 (2020).
- Parrish, C. C., Deibel, D., Thompson, R. J. Effect of sinking spring phytoplankton blooms on lipid content and composition in suprabenthic and benthic invertebrates in a cold ocean coastal environment. Marine Ecology Progress Series. 391, 33-51 (2009).
- Sinanoglou, V. J., et al. On the combined application of Iatroscan TLC-FID and GC-FID to identify total, neutral, and polar lipids and their fatty acids extracted from foods. ISRN Chromatography. , 59024 (2013).
- Peters-Didier, J., Sewell, M. A. Maternal investment and nutrient utilization during early larval development of the sea cucumber Australostichopus mollis. Marine Biology. 164, 178 (2017).
- Triesch, N., et al. Concerted measurements of lipids in seawater and on submicron aerosol particles at the Cape Verde Islands: biogenic sources, selective transfer and high enrichments. Atmospheric Chemistry and Physics. 21, 4267-4283 (2021).
- Parrish, C. C., Bodennec, G., Gentien, P. Determination of glycoglycerolipids by Chromarod thin-layer chromatography with Iatroscan flame ionization detection. Journal of Chromatography A. 741, 91-97 (1996).
- Mejri, S., et al. Bonefish (Albula vulpes) oocyte lipid class and fatty acid composition related to their development. Environmental Biology of Fishes. 102, 221-232 (2019).
- Sewell, M. A. Utilization of lipids during early development of the sea urchin Evechinus chloroticus. Marine Ecology Progress Series. 304, 133-142 (2005).
- Parrish, C. C., Bodennec, G., Gentien, P. Separation of polyunsaturated and saturated lipids from marine phytoplankton on silica gel coated Chromarods. Journal of Chromatography A. 607, 97-104 (1992).
- Stevens, C. J., Deibel, D., Parrish, C. C. Incorporation of bacterial fatty acids and changes in a wax ester-based omnivory index during a long-term incubation experiment with Calanus glacialis Jaschnov. Journal of Experimental Marine Biology and Ecology. 303, 135-156 (2004).
- Goutx, M., et al. Short term summer to autumn variability of dissolved lipid classes in the Ligurian Sea (NW Mediterranean). Biogeosciences. 6, 1229-1246 (2009).
- Conlan, J. A., Rocker, M. M., Francis, D. S. A. comparison of two common sample preparation techniques for lipid and fatty acid analysis in three different coral morphotypes reveals quantitative and qualitative differences. PeerJ. 5, 3645 (2017).
