Farelerde Tümör Sızan CD8 + T Hücrelerinin Dinamiğini Değerlendirmek için Tümör Transplantasyonu
Summary
Burada, bir fare tümörü modelinde tümöre özgü ve periferi kaynaklı tümör kaynaklı lenfositlerin karakterizasyonu için bir tümör transplantasyon protokolü sunulmaktadır. Alıcı kaynaklı immün hücrelerin akışının akım sitometrisi ile spesifik olarak izlenmesi, antitümör immün yanıtlar sırasında bu hücrelerin fenotipik ve fonksiyonel değişikliklerinin dinamiklerini ortaya koymaktadır.
Abstract
T hücresi aracılı bağışıklık, tümörlere karşı immün yanıtlarda çok önemli bir rol oynarken, sitotoksik T lenfositler (CTL’ler) kanserli hücrelerin eradikasyonunda öncü rol oynamaktadır. Bununla birlikte, tümör mikroçevresi (TME) içindeki tümör antijenine özgü CD8 + T hücrelerinin kökenleri ve yenilenmesi belirsizliğini korumaktadır. Bu protokol, vekil neoantijen, ovalbümin (OVA) ve TCR transgenik OT-I farelerini istikrarlı bir şekilde eksprese eden B16F10-OVA melanom hücre hattını kullanır; burada CD8 + T hücrelerinin% 90’ından fazlası, sınıf I majör histouyumluluk kompleksi (MHC) molekülü H2-Kb’ye bağlı OVA türevi peptid OVA 257-264’ü (SIINFEKL) spesifik olarak tanır. Bu özellikler, tümörigenez sırasında antijene özgü T hücre yanıtlarının incelenmesini sağlar.
Bu modeli tümör nakli cerrahisi ile birleştirerek, donörlerden gelen tümör dokuları, alıcı kaynaklı bağışıklık hücrelerinin nakledilen donör dokulara akışını kesin olarak izlemek için tümörle eşleşen sinjenik alıcı farelere nakledildi ve tümöre özgü ve periferi kaynaklı antijene özgü CD8 + ‘nın bağışıklık yanıtlarının analizine izin verdi. T hücreleri. Bu iki popülasyon arasında dinamik bir geçişin gerçekleştiği bulunmuştur. Toplu olarak, bu deneysel tasarım, TME’deki CD8 + T hücrelerinin bağışıklık tepkilerini tam olarak araştırmak için başka bir yaklaşım sağlamıştır ve bu da tümör immünolojisine yeni bir ışık tutacaktır.
Introduction
CD8 + T hücre aracılı immün yanıt, tümör büyümesini kontrol etmede çok önemli bir rol oynar. Tümörigenez sırasında, naif CD8 + T hücreleri, MHC sınıf I kısıtlı bir şekilde antijen tanınması üzerine aktive olur ve daha sonra efektör hücrelere farklılaşır ve tümör kütlesi 1,2’ye sızar. Bununla birlikte, tümör mikroortamında (TME), uzun süreli antijen maruziyeti ve immünosüpresif faktörler, infiltre edilmiş tümöre özgü CD8 + T hücrelerini “tükenme” olarak bilinen hiporesponsive bir duruma yönlendirir3. Tükenmiş T hücreleri (Tex), akut viral enfeksiyonda hem transkripsiyonel hem de epigenetik olarak üretilen efektör veya hafıza T hücrelerinden farklıdır. Bu Tex hücreleri esas olarak bir dizi inhibitör reseptörün sürekli ve yüksek ekspresyonunun yanı sıra efektör fonksiyonlarının hiyerarşik kaybı ile karakterizedir. Ayrıca, tükenmiş CD8 + T hücrelerinin bozulmuş proliferatif kapasitesi, tümöre özgü T hücrelerinin sayısının azalmasına neden olur, böylece TME içindeki artık CD8 + T hücreleri, tümör progresyonuna karşı yeterli koruyucu bağışıklığı zar zor sağlayabilir3. Bu nedenle, intratümöral antijene özgü CD8 + T hücrelerinin bakımı veya güçlendirilmesi, tümör represyonu için vazgeçilmezdir.
Ayrıca, immün kontrol noktası blokajı (ICB) tedavisinin, T hücresi infiltrasyonunu artırarak tümörlerde Tex’i yeniden canlandırdığına ve dolayısıyla T hücre sayılarını ve tümör baskısını artırmak için T hücresi fonksiyonlarını gençleştirdiğine inanılmaktadır. ICB tedavisinin yaygın olarak uygulanması, kanser tedavisi manzarasını değiştirmiş ve hastaların önemli bir alt kümesi kalıcı yanıtlar yaşamıştır 4,5,6. Bununla birlikte, hastaların ve kanser türlerinin çoğunluğu ICB’ye yanıt vermez veya sadece geçici olarak yanıt vermez. TME’de yetersiz T hücre infiltrasyonunun ICB direncini oluşturan temel mekanizmalardan biri olduğu varsayılmıştır 7,8.
Birçok çalışma, tümör infiltrasyonu yapan CD8 + T hücrelerinin (TIL’ler) hem hastalarda hem de fare modellerinde heterojenliğini göstermiştir 9,10,11,12. Bir tümör kütlesinde T hücre faktörü-1’i (TCF1) eksprese eden CD8 + T hücrelerinin bir alt kümesinin, ölümcül tükenmiş T hücrelerine yol açabilecek kök hücre benzeri özellikler sergilediği ve ICB tedavisi 12,13,14,15,16,17,18,19,20 sonrası proliferasyon patlamasından sorumlu olduğu doğrulanmıştır. 21,22. Bununla birlikte, TME’de antijene özgü TCF1 + CD8 + T hücrelerinin sadece küçük bir kısmının bulunduğu ve ICB 23,24,25,26’ya yanıt olarak genişlemiş bir farklılaşmış soy havuzu oluşturduğu kanıtlanmıştır. Bu popülasyonun sınırlı büyüklüğünün, tümör progresyonunu kontrol etmek için sitotoksik T lenfositlerin (CTL’ler) kalıcılığını sağlamak için yeterli olup olmadığı bilinmemektedir ve çevre dokulardan yenilenme olup olmadığı daha fazla araştırma gerektirmektedir. Ayrıca, son araştırmalar, önceden var olan tümöre özgü T hücrelerinin yetersiz canlandırma kapasitesini ve anti-programlanmış hücre ölümü proteini 1 tedavisinden sonra yeni, daha önce var olmayan klonotiplerin ortaya çıktığını göstermektedir. Bu, kontrol noktası blokajına T hücresi yanıtının, T hücresi klonlarının farklı bir repertuarının yeni akışından kaynaklanabileceğini göstermektedir27. TME’de tümör reaktif olmayan sitotoksik T hücre fraksiyonunun varlığı ile birlikte, bu bulgular periferi kaynaklı CD8 + T hücrelerinin rolünü incelemek için bir tümör allogreft modelinin kurulmasını sağlamıştır11.
Şimdiye kadar, çeşitli tümör implantasyonlarının yanı sıra immün hücre evlat edinen transferi, tümör immünolojisi alanında yaygın olarak kullanılmaktadır28. TIL’ler, periferik kan mononükleer hücreleri ve diğer dokulardan kaynaklanan tümör-reaktif bağışıklık hücreleri bu yöntemler kullanılarak iyi karakterize edilebilir. Bununla birlikte, sistemik ve lokal antitümör bağışıklık arasındaki etkileşimleri incelerken, bu modeller periferiden ve TME’den türetilen bağışıklık hücreleri arasındaki etkileşimleri incelemek için yetersiz görünmektedir. Burada, tümör dokuları, alıcı kaynaklı bağışıklık hücrelerinin akışını kesin olarak izlemek ve TME’deki donör kaynaklı hücreleri eşzamanlı olarak gözlemlemek için donörlerden tümörle eşleşen alıcı farelere nakledildi.
Bu çalışmada, vekil neoantijen ovalbümini kararlı bir şekilde eksprese eden B16F10-OVA melanom hücre hattı ile murin sinjenik bir melanom modeli oluşturulmuştur. CD8 + T hücrelerinin% 90’ından fazlasının, sınıf I MHC molekülü H2-Kb’ye bağlı OVA türevi peptid OVA 257-264’ü (SIINFEKL) spesifik olarak tanıdığı TCR transgenik OT-I fareleri, B16F10-OVA tümör modelinde geliştirilen antijene özgü T hücresi yanıtlarının incelenmesini sağlar. Bu model tümör transplantasyonu ile birleştirildiğinde, tümöre özgü ve periferi kaynaklı antijen spesifik CD8 + T hücrelerinin immün yanıtları karşılaştırılarak bu iki popülasyon arasında dinamik bir geçiş ortaya çıkarıldı. Toplu olarak, bu deneysel tasarım, TME’deki CD8 + T hücrelerinin bağışıklık tepkilerini tam olarak araştırmak için başka bir yaklaşım sağlamıştır ve bu da TME’deki tümöre özgü T hücresi bağışıklık yanıtlarının dinamiklerine yeni bir ışık tutmaktadır.
Protocol
Representative Results
Discussion
T hücre aracılı bağışıklık, tümörlere karşı bağışıklık yanıtlarında çok önemli bir rol oynarken, CTL’ler kanserli hücrelerin yok edilmesinde öncü rol oynamaktadır. Bununla birlikte, TME içindeki tümör antijenine özgü CTL’lerin kökenleri aydınlatılamamıştır30. Bu tümör transplantasyon protokolünün kullanılması, kök benzeri TCF1 + progenitör CD8 + T hücrelerinin varlığına rağmen, intratümöral antijene özgü CD8 + T hücrelerin…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma, Seçkin Genç Akademisyenler için Ulusal Doğa Bilimleri Fonu (LY’ye No. 31825011) ve Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı’ndan (QH’ye No. 31900643, ZW’ye No. 31900656) hibelerle desteklenmiştir.
Materials
| 0.22 μm filter | Millipore | SLGPR33RB | |
| 1 mL tuberculin syringe | KDL | BB000925 | |
| 1.5 mL centrifuge tube | KIRGEN | KG2211 | |
| 100 U insulin syringe | BD Biosciences | 320310 | |
| 15 mL conical tube | BEAVER | 43008 | |
| 2,2,2-Tribromoethanol (Avertin) | Sigma | T48402-25G | |
| 2-Methyl-2-butanol | Sigma | 240486-100ML | |
| 70 μm nylon cell strainer | BD Falcon | 352350 | |
| APC anti-mouse CD45.1 | BioLegend | 110714 | Clone:A20 |
| B16F10-OVA cell line | bluefbio | BFN607200447 | |
| BSA-V (bovine serum albumin) | Bioss | bs-0292P | |
| BV421 Mouse Anti-Mouse CD45.2 | BD Horizon | 562895 | Clone:104 |
| cell culture dish | BEAVER | 43701/43702/43703 | |
| centrifuge | Eppendorf | 5810R-A462/5424R | |
| cyclophosphamide | Sigma | C0768-25G | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Gibco | C11995500BT | |
| EasySep Mouse CD8+ T Cell Isolation Kit | Stemcell Technologies | 19853 | |
| EDTA | Sigma | EDS-500g | |
| FACS tubes | BD Falcon | 352052 | |
| fetal bovine serum | Gibco | 10270-106 | |
| flow cytometer | BD | FACSCanto II | |
| hemocytometer | PorLab Scientific | HM330 | |
| isoflurane | RWD life science | R510-22-16 | |
| KHCO3 | Sangon Biotech | A501195-0500 | |
| LIVE/DEAD Fixable Near-IR Dead Cell Stain Kit, for 633 or 635 nm excitation | Life Technologies | L10199 | |
| needle carrier | RWD Life Science | F31034-14 | |
| NH4Cl | Sangon Biotech | A501569-0500 | |
| paraformaldehyde | Beyotime | P0099-500ml | |
| PE anti-mouse TCR Vα2 | BioLegend | 127808 | Clone:B20.1 |
| Pen Strep Glutamine (100x) | Gibco | 10378-016 | |
| PerCP/Cy5.5 anti-mouse CD8a | BioLegend | 100734 | Clone:53-6.7 |
| RPMI-1640 | Sigma | R8758-500ML | |
| sodium azide | Sigma | S2002 | |
| surgical forceps | RWD Life Science | F12005-10 | |
| surgical scissors | RWD Life Science | S12003-09 | |
| suture thread | RWD Life Science | F34004-30 | |
| trypsin-EDTA | Sigma | T4049-100ml |
References
- Blank, C. U., et al. Defining ‘T cell exhaustion. Nature Reviews Immunology. 19 (11), 665-674 (2019).
- Leko, V., Rosenberg, S. A. Identifying and targeting human tumor antigens for T cell-based immunotherapy of solid tumors. Cancer Cell. 38 (4), 454-472 (2020).
- McLane, L. M., Abdel-Hakeem, M. S., Wherry, E. J. CD8 T cell exhaustion during chronic viral infection and cancer. Annual Review of Immunology. 37, 457-495 (2019).
- Davis, M. M., Brodin, P. Rebooting human immunology. Annual Review of Immunology. 36, 843-864 (2018).
- Sharma, P., Allison, J. P. The future of immune checkpoint therapy. Science. 348 (6230), 56-61 (2015).
- Littman, D. R. Releasing the brakes on cancer immunotherapy. Cell. 373 (16), 1490-1492 (2015).
- Verma, V., et al. PD-1 blockade in subprimed CD8 cells induces dysfunctional PD-1(+)CD38(hi) cells and anti-PD-1 resistance. Nature Immunology. 20, 1231-1243 (2019).
- Hashimoto, M., et al. CD8 T cell exhaustion in chronic infection and cancer: opportunities for interventions. Annual Review of Medicine. 69, 301-318 (2018).
- Dammeijer, F., et al. The PD-1/PD-L1-checkpoint restrains T cell immunity in tumor-draining lymph nodes. Cancer Cell. 38 (5), 685-700 (2020).
- Buchwald, Z. S., et al. Tumor-draining lymph node is important for a robust abscopal effect stimulated by radiotherapy. Journal for ImmunoTherapy of Cancer. 8 (2), 000867 (2020).
- Philip, M., Schietinger, A. Heterogeneity and fate choice: T cell exhaustion in cancer and chronic infections. Current Opinion in Immunology. 58, 98-103 (2019).
- Miller, B. C., et al. Subsets of exhausted CD8(+) T cells differentially mediate tumor control and respond to checkpoint blockade. Nature Immunology. 20, 326-336 (2019).
- Wu, T. D., et al. Peripheral T cell expansion predicts tumour infiltration and clinical response. Nature. 579, 274-278 (2020).
- Im, S. J., Konieczny, B. T., Hudson, W. H., Masopust, D., Ahmed, R. PD-1+ stemlike CD8 T cells are resident in lymphoid tissues during persistent LCMV infection. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United State of America. 117 (8), 4292-4299 (2020).
- Beltra, J. C., et al. Developmental relationships of four exhausted CD8(+) T cell subsets reveals underlying transcriptional and epigenetic landscape control mechanisms. Immunity. 52 (5), 825-841 (2020).
- Myers, L. M., et al. A functional subset of CD8(+) T cells during chronic exhaustion is defined by SIRPalpha expression. Nature Communications. 10 (1), 794 (2019).
- Jansen, C. S., et al. An intra-tumoral niche maintains and differentiates stem-like CD8 T cells. Nature. 576, 465-470 (2019).
- Jadhav, R. R., et al. Epigenetic signature of PD-1+ TCF1+ CD8 T cells that act as resource cells during chronic viral infection and respond to PD-1 blockade. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United State of America. 116 (28), 14113-14118 (2019).
- Li, H., et al. Dysfunctional CD8 T cells form a proliferative, dynamically regulated compartment within human melanoma. Cell. 176 (4), 775-789 (2018).
- Kurtulus, S., et al. Checkpoint blockade immunotherapy induces dynamic changes in PD-1(-)CD8(+) tumor-infiltrating T cells. Immunity. 50 (1), 181-194 (2019).
- Fransen, M. F., et al. Tumor-draining lymph nodes are pivotal in PD-1/PD-L1 checkpoint therapy. JCI Insight. 3 (23), 124507 (2018).
- E, J. F., et al. CD8(+)CXCR5(+) T cells in tumor-draining lymph nodes are highly activated and predict better prognosis in colorectal cancer. Human Immunology. 79 (6), 446-452 (2018).
- Snell, L. M., et al. CD8(+) T cell priming in established chronic viral infection preferentially directs differentiation of memory-like cells for sustained immunity. Immunity. 49 (4), 678-694 (2018).
- Siddiqui, I., et al. Intratumoral Tcf1(+)PD-1(+)CD8(+) T cells with stem-like properties promote tumor control in response to vaccination and checkpoint blockade immunotherapy. Immunity. 50 (1), 195-211 (2019).
- Wang, Y., et al. The transcription factor TCF1 preserves the effector function of exhausted CD8 T cells during chronic viral infection. Frontiers in Immunology. 10, 169 (2019).
- Krishna, S., et al. Stem-like CD8 T cells mediate response of adoptive cell immunotherapy against human cancer. Science. 370 (6522), 1328-1334 (2020).
- Yost, K. E., et al. Clonal replacement of tumor-specific T cells following PD-1 blockade. Nature Medicine. 25, 1251-1259 (2019).
- Zitvogel, L., Pitt, J. M., Daillere, R., Smyth, M. J., Kroemer, G. Mouse models in oncoimmunology. Nature Reviews Cancer. 16 (12), 759-773 (2016).
- Li, Y., et al. Bcl6 preserves the suppressive function of regulatory T cells during tumorigenesis. Frontiers in Immunology. 11, 806 (2020).
- Yu, D., Ye, L. A portrait of CXCR5(+) follicular cytotoxic CD8(+) T cells. Trends in Immunology. 39 (12), 965-979 (2018).
- Bracci, L., et al. Cyclophosphamide enhances the antitumor efficacy of adoptively transferred immune cells through the induction of cytokine expression, B-cell and T-cell homeostatic proliferation, and specific tumor infiltration. Clinical Cancer Research. 13 (2), 644-653 (2007).
- Salem, M. L., El-Naggar, S. A., Mahmoud, H. A., Elgharabawy, R. M., Bader, A. M. Cyclophosphamide eradicates murine immunogenic tumor coding for a non-self-antigen and induces antitumor immunity. International Journal of Immunopathology and Pharmacology. 32, 1-5 (2018).
- Thorsson, V., et al. The Immune landscape of cancer. Immunity. 48 (4), 812-830 (2018).
