استخدام زراعة الأعضاء من نوع Trowell لدراسة تنظيم الخلايا الجذعية للأسنان
Summary
تم استخدام طريقة زراعة الأعضاء من نوع Trowell لكشف شبكات الإشارات المعقدة التي تحكم نمو الأسنان ، ومؤخرا ، لدراسة التنظيم الذي ينطوي عليه الخلايا الجذعية لقاطعة الفأر التي تنمو باستمرار. تسهل النماذج الحيوانية الفلورية وطرق التصوير الحي التحليلات المتعمقة للخلايا الجذعية للأسنان وبيئتها المكروية المتخصصة.
Abstract
يعتمد نمو الأعضاء ووظيفتها وتجديدها على الخلايا الجذعية ، والتي تتواجد داخل مساحات تشريحية منفصلة تسمى منافذ الخلايا الجذعية. توفر قاطعة الفأر المتنامية باستمرار نموذجا ممتازا لدراسة الخلايا الجذعية الخاصة بالأنسجة. توجد الخلايا الجذعية الخاصة بالأنسجة الظهارية للقاطعة في الطرف القريب من السن في مكان يسمى حلقة عنق الرحم. أنها توفر تدفقا مستمرا للخلايا لموازنة التآكل المستمر لطرف السن ذاتي الشحذ. يظهر هنا بروتوكول مفصل لعزل وثقافة الطرف القريب من قاطعة الفأر التي تضم الخلايا الجذعية ومكانتها. هذا هو بروتوكول زراعة الأعضاء المعدل من نوع Trowell الذي يتيح زراعة قطع الأنسجة في المختبر (explants) ، بالإضافة إلى شرائح الأنسجة السميكة في واجهة السائل / الهواء على مرشح مدعوم بشبكة معدنية. يتيح بروتوكول زراعة الأعضاء الموصوف هنا التلاعب بالأنسجة غير الممكنة في الجسم الحي ، وعندما يقترن باستخدام مراسل (مراسلين) فلوري ، فإنه يوفر منصة لتحديد وتتبع مجموعات الخلايا المنفصلة في الأنسجة الحية بمرور الوقت ، بما في ذلك الخلايا الجذعية. يمكن اختبار الجزيئات التنظيمية المختلفة والمركبات الدوائية في هذا النظام لتأثيرها على الخلايا الجذعية ومنافذها. يوفر هذا في النهاية أداة قيمة لدراسة تنظيم الخلايا الجذعية وصيانتها.
Introduction
تنمو قواطع الفأر باستمرار بسبب الحفاظ مدى الحياة على الخلايا الجذعية (SC) التي تدعم الإنتاج المستمر لمكونات الأسنان. وتشمل هذه SCs الظهارية ، التي تولد الأرومات المينائية المنتجة للمينا ، والخلايا الجذعية الوسيطة (MSCs) ، التي تولد الأرومات السنية المنتجة للعاج ، من بين خلايا أخرى1. تم تحديد SCs الظهارية في القواطع المتنامية باستمرار في البداية على أنها خلايا تحتفظ بالتسمية 2,3 ومنذ ذلك الحين ثبت أنها تعبر عن عدد من جينات الجذعية المعروفة ، بما في ذلك Sox24. تشترك هذه الخلايا في سمات مشتركة مع SCs الظهارية في الأعضاء الأخرى وتتواجد داخل مكانة SC تسمى حلقة عنق الرحم الموجودة على الجانب الشفوي من القاطعة. المكانة هي كيان ديناميكي يتكون من خلايا ومصفوفة خارج الخلية تتحكم في نشاط SC5. أظهرت دراسات تتبع النسب أن Sox2+ SCs الظهارية يمكنها تجديد المقصورة الظهارية بأكملها من السن وأنها ضرورية لتشكيل الأسنان المتتالية 6,7. يتم تجنيد MSCs ذات إمكانات إصلاح العاج أو التجدد إلى حد كبير من خارج العضو من خلال الأوعية الدموية والأعصاب8،9،10،11 ، وبالتالي ، توفير نموذج مناسب لدراسة التوظيف والهجرة والإسكان لسكان MSC.
إن دراسة SCs في الجسم الحي ليست ممكنة دائما ، لأن العديد من التلاعب الجيني و / أو الدوائي يمكن أن يؤثر على توازن الأعضاء و / أو يكون له عواقب مميتة. لذلك ، توفر زراعة الأعضاء أداة ممتازة لدراسة تنظيم SCs ومنافذها في المختبر. تم تطوير نظام زراعة الأعضاء الذي يستخدم شبكة معدنية في البداية بواسطة Trowell12 لدراسة تطور الأعضاء وتم تعديله بواسطة Saxen13 لدراسة الإشارات الاستقرائية في تطور الكلى. منذ ذلك الحين ، تم تطبيق هذه الطريقة في المختبر لزراعة كل أو جزء من العضو بنجاح في مجالات مختلفة. في مجال تطور الأسنان ، تم استخدام هذه الطريقة على نطاق واسع لدراسة التفاعلات الظهارية الوسيطة التي تحكم نمو الأسنان14 وتشكيل الأسنان المتتالية15. أظهر عمل مختبر Thesleff فائدة هذا النظام للتحليل الزمني لنمو الأسنان وتكوينها ، لتحليل تأثير الجزيئات المختلفة وعوامل النمو على نمو الأسنان ، وللتصوير الحي بفاصل زمني لتطور الأسنان16,17. في الآونة الأخيرة ، تم استخدام هذه الطريقة لدراسة تنظيم SCs القاطعة ومكانتها18،19 ، والتي تم وصفها بالتفصيل هنا.
Protocol
Representative Results
Discussion
تم استخدام زراعة الأعضاء في المختبر على نطاق واسع لدراسة الإمكانات الاستقرائية والتفاعلات الظهارية الوسيطة التي تحكم نمو الأعضاء والتشكل. أظهر مختبر Thesleff كيفية تكييف تعديل Saxén لثقافة الأعضاء من نوع Trowell واستخدامها لدراسة تطور الأسنان14. جعلت الظروف والتطورات القابلة لل…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم هذه الدراسة من قبل مؤسسة جين وآتوس إركو.
Materials
| 1-mL plastic syringes | |||
| Disposable 20/26 gauge hypodermic needles | Terumo | ||
| DMEM | Gibco | 61965-026 | |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline | Gibco | 14287 | |
| Extra Fine Bonn Scissors | F.S.T. | 14084-08 | |
| F-12 | Gibco | 31765-027 | |
| FBS South American (CE) | LifeTechn. | 10270106 | divide in aliquotes, store at -20°C |
| Glass bead sterilizer, Steri 250 Seconds-Sterilizer | Simon Keller Ltd | 4AJ-6285884 | |
| GlutaMAX-1 (200 mM L-alanyl-L-glutamine dipeptide) | Gibco | 35050-038 | |
| Isopore Polycarb.Filters, 0,1 um 25-mm diameter | MerckMillipore | VCTP02500 | Store in 70% ethanol at room temperature. |
| L-Ascobic Acid | Sigma | A4544-25g | diluted 100 mg/ml in MilliQ, filter strerilized and divided in 20μl aliquotes, store at dark, -20°C |
| Low melting agarose | TopVision | R0801 | |
| Metal grids | Commercially available, or self-made from stainless-steel mesh (corrosion resistant, size of mesh 0.7 mm). Cut approximately 30 mm diameter disk and bend the edges to give 3 mm height. Use nails to make holes. | ||
| Micro forceps | Medicon | 07.60.03 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | ||
| Penicillin-Streptomycin (10,000U/ml) sol. | Gibco | 15140-148 | |
| Petri dishes, Soda-Lime glass | DWK Life Sciences | 9170442 | |
| Petridish 35 mm, with vent | Duran | 237554008 | |
| Petridish 90 mm, no vent classic | Thermo Fisher | 101RT/C | |
| Small scissors |
References
- Balic, A. Biology explaining tooth repair and regeneration: A mini-review. Gerontology. 64 (4), 382-388 (2018).
- Harada, H., et al. Localization of putative stem cells in dental epithelium and their association with Notch and FGF signaling. The Journal of Cell Biology. 147 (1), 105-120 (1999).
- Smith, C. E., Warshawsky, H. Cellular renewal in the enamel organ and the odontoblast layer of the rat incisor as followed by radioautography using 3H-thymidine. The Anatomical Record. 183 (4), 523-561 (1975).
- Balic, A., Thesleff, I. Tissue interactions regulating tooth development and renewal. Current Topics in Developmental Biology. 115, 157-186 (2015).
- Scadden, D. T. The stem-cell niche as an entity of action. Nature. 441 (7097), 1075-1079 (2006).
- Juuri, E., et al. Sox2 marks epithelial competence to generate teeth in mammals and reptiles. Development. 140 (7), 1424-1432 (2013).
- Juuri, E., et al. Sox2+ stem cells contribute to all epithelial lineages of the tooth via Sfrp5+ progenitors. Developmental Cell. 23 (2), 317-328 (2012).
- Feng, J., Mantesso, A., De Bari, C., Nishiyama, A., Sharpe, P. T. Dual origin of mesenchymal stem cells contributing to organ growth and repair. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (16), 6503-6508 (2011).
- Kaukua, N., et al. Glial origin of mesenchymal stem cells in a tooth model system. Nature. 513 (7519), 551-554 (2014).
- Zhao, H., et al. Secretion of shh by a neurovascular bundle niche supports mesenchymal stem cell homeostasis in the adult mouse incisor. Cell Stem Cell. 14 (2), 160-173 (2014).
- Vidovic, I., et al. alphaSMA-expressing perivascular cells represent dental pulp progenitors in vivo. Journal of Dental Research. 96 (3), 323-330 (2017).
- Trowell, O. A. A modified technique for organ culture in vitro. Experimental Cell Research. 6 (1), 246-248 (1954).
- Saxen, L., Vainio, T., Toivonen, S. Effect of polyoma virus on mouse kidney rudiment in vitro. Journal of the National Cancer Institute. 29, 597-631 (1962).
- Thesleff, I., Sahlberg, C. Organ culture in the analysis of tissue interactions. Methods in Molecular Biology. 461, 23-30 (2008).
- Jarvinen, E., Shimomura-Kuroki, J., Balic, A., Jussila, M., Thesleff, I. Mesenchymal Wnt/beta-catenin signaling limits tooth number. Development. 145 (4), (2018).
- Ahtiainen, L., Uski, I., Thesleff, I., Mikkola, M. L. Early epithelial signaling center governs tooth budding morphogenesis. The Journal of Cell Biology. 214 (6), 753-767 (2016).
- Narhi, K., Thesleff, I. Explant culture of embryonic craniofacial tissues: analyzing effects of signaling molecules on gene expression. Methods in Molecular Biology. 666, 253-267 (2010).
- Yang, Z., Balic, A., Michon, F., Juuri, E., Thesleff, I. Mesenchymal Wnt/beta-Catenin signaling controls epithelial stem cell homeostasis in teeth by inhibiting the antiapoptotic effect of Fgf10. Stem Cells. 33 (5), 1670-1681 (2015).
- Binder, M., et al. Functionally distinctive Ptch receptors establish multimodal hedgehog signaling in the tooth epithelial stem cell niche. Stem Cells. 37 (9), 1238-1248 (2019).
- Harada, H., et al. Localization of putative stem cells in dental epithelium and their association with Notch and FGF signaling. The Journal of Cell Biology. 147 (1), 105-120 (1999).
- Seidel, K., et al. Hedgehog signaling regulates the generation of ameloblast progenitors in the continuously growing mouse incisor. Development. 137 (22), 3753-3761 (2010).
- Hadjantonakis, A. K., Nagy, A. FACS for the isolation of individual cells from transgenic mice harboring a fluorescent protein reporter. Genesis. 27 (3), 95-98 (2000).
- Yu, Y. A., Szalay, A. A., Wang, G., Oberg, K. Visualization of molecular and cellular events with green fluorescent proteins in developing embryos: a review. Luminescence. 18 (1), 1-18 (2003).
- D’Amour, K. A., Gage, F. H. Genetic and functional differences between multipotent neural and pluripotent embryonic stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100, 11866-11872 (2003).
- Chavez, M. G., et al. Isolation and culture of dental epithelial stem cells from the adult mouse incisor. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (87), (2014).
- Binder, M., et al. Novel strategies for expansion of tooth epithelial stem cells and ameloblast generation. Science Reports. 10 (1), 4963 (2020).
