JoVE Journal > Bioengineering
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
自动翻译
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
生物工程

Het ontwikkelen van 3D georganiseerd menselijk hartweefsel binnen een microfluïdisch platform

Published: June 15, 2021
doi:
10.3791/62539
,
1School of Biological and Health Systems Engineering,Arizona State University, 2Biodesign Virginia G. Piper Center for Personalized Diagnostics,Arizona State University

Summary

Het doel van dit protocol is om de ontwikkeling van een driedimensionaal (3D) microfluïdisch model van sterk uitgelijnd menselijk hartweefsel, samengesteld uit stamcel-afgeleide cardiomyocyten, samen met hartfibblasten (CFs) in een biomimetische, op collageen gebaseerde hydrogel, uit te leggen en aan te tonen, voor toepassingen in hartweefseltechniek, geneesmiddelenscreening en ziektemodellering.

Abstract

De belangrijkste doodsoorzaak wereldwijd blijft bestaan als hart- en vaatziekten (CVD). Het modelleren van de fysiologische en biologische complexiteit van de hartspier, het myocardium, is echter notoir moeilijk in vitro te bereiken. Voornamelijk liggen obstakels in de behoefte aan menselijke cardiomyocyten (CMs) die volwassen zijn of volwassen fenotypen vertonen en met succes de cellulaire complexiteit en ingewikkelde 3D-architectuur van het myocardium kunnen repliceren. Helaas is de inkoop van levensvatbare menselijke CMs vanwege ethische zorgen en gebrek aan beschikbaar primair van de patiënt afgeleid menselijk hartweefsel, in combinatie met de minimale proliferatie van CMs, een beperkende stap geweest voor hartweefseltechnologie. Hiertoe is het meeste onderzoek overgegaan op cardiale differentiatie van door de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen (hiPSC’s) als de primaire bron van menselijke CMs, wat resulteert in de brede integratie van hiPSC-CMs in in vitro assays voor hartweefselmodellering.

Hier in dit werk demonstreren we een protocol voor het ontwikkelen van een 3D volwassen stamcel-afgeleid menselijk hartweefsel binnen een microfluïdisch apparaat. We leggen specifiek de productie uit en demonstreren visueel de productie van een 3D in vitro anisotropisch cardiale weefsel-op-een-chip model van hiPSC-afgeleide CMs. We beschrijven voornamelijk een zuiveringsprotocol om te selecteren voor CMs, de co-cultuur van cellen met een gedefinieerde verhouding via het mengen van CMs met menselijke CB’s (hCFs) en suspensie van deze co-cultuur binnen de op collageen gebaseerde hydrogel. We demonstreren verder de injectie van de met cellen beladen hydrogel in ons goed gedefinieerde microfluïdische apparaat, ingebed met verspringende elliptische microposten die dienen als oppervlaktetopografie om een hoge mate van uitlijning van de omliggende cellen en de hydrogelmatrix te induceren, waarbij de architectuur van het inheemse myocardium wordt nagebootst. We stellen ons voor dat het voorgestelde 3D anisotrope cardiale weefsel-op-chip model geschikt is voor fundamentele biologiestudies, ziektemodellering en, door het gebruik ervan als screeningsinstrument, farmaceutische tests.

Introduction

Weefseltechniekbenaderingen zijn de afgelopen jaren op grote schaal onderzocht om in vivo klinische bevindingen in regeneratieve geneeskunde enziektemodellering 1,2te begeleiden . Er is met name aanzienlijke nadruk gelegd op in vitro hartweefselmodellering vanwege de inherente moeilijkheden bij het verkrijgen van menselijk primair hartweefsel en het produceren van fysiologisch relevante in vitro surrogaten , waardoor het fundamentele begrip van de complexe mechanismen van hart- en vaatziekten (CVD ‘s)1,3wordtbeperkt . Traditionele modellen hebben vaak 2D monolayer cultuurtesten betrokken. Het belang van het cultiveren van hartcellen in een 3D-omgeving om zowel het inheemse landschap van het myocardium als complexe cellulaire interacties na te bootsen, is echter uitgebreid gekarakteriseerd4,5. Bovendien bevatten de meeste modellen die tot nu toe zijn geproduceerd een monocultuur van CMs die zich onderscheiden van stamcellen. Het hart bestaat echter uit meerdere celtypen6 binnen een complexe 3D-architectuur7, wat de kritieke noodzaak rechtvaardigt om de complexiteit van de weefselsamenstelling binnen 3D-in vitromodellen te verbeteren om cellulaire bestanddelen van het inheemse myocardium beter na te bootsen.

Tot op heden zijn veel verschillende benaderingen onderzocht om biomimetische 3D-modellen van myocardium8te produceren. Deze benaderingen variëren van experimentele opstellingen die de real-time berekening van gegenereerde kracht mogelijk maken, van monocultuur-CMs gezaaid op dunne films (veronderstelde spierdunne films (MTF’s))9, tot co-kweek hartcellen in 3D-hydrogelmatrices die zijn opgehangen tussen vrijstaande cantilevers (verondersteld ontworpen hartweefsels (EHT’s))10. Andere benaderingen waren gericht op het toepassen van micromoldingtechnieken om myocard anisotropie na te bootsen, van monocultuur-CMs in een 3D-hydrogel die tussen uitstekende microposten in een weefselpleister11hangt , tot monocultuur-CMs die tussen ingesprongen microgrooves12,13zijn gezaaid . Er zijn inherente voor- en nadelen aan elk van deze methoden, daarom is het relevant om de techniek te gebruiken die aansluit bij de beoogde toepassing en de bijbehorende biologische vraag.

Het vermogen om de rijping van stamcel-afgeleide CMs te verbeteren is essentieel voor de succesvolle in vitro engineering van volwassen myocardweefsel en de vertaling van latere bevindingen naar klinische interpretaties. Hiertoe zijn methoden voor volwassen CMs op grote schaal onderzocht, zowel in 2D als 3D14,15,16. Bijvoorbeeld, elektrische stimulatie opgenomen in EHT’s, gedwongen uitlijning van CMs met oppervlaktetopografie, signaalsignalen, groeifactoren uit co-cultuur, en/of 3D-hydrogelcondities, enz., leiden allemaal tot een verandering ten gunste van CM-rijping in ten minste een van de volgende: celmorfologie, calciumbehandeling, sarctische structuur, genexpressie of contractiele kracht.

Van deze modellen behouden de benaderingen die microfluïdische platforms gebruiken bepaalde voordelen in de natuur, zoals controle van verlopen, beperkte celinvoer en minimaal noodzakelijke reagentia. Bovendien kunnen veel biologische duplo’s tegelijk worden gegenereerd met behulp van microfluïdische platforms , wat dient om het biologische mechanisme van belang beter te ontleden en de experimentele steekproefgrootte te vergroten ten gunste van statistische macht17,18,19. Bovendien maakt het gebruik van fotolithografie in het fabricageproces van microfluïdische apparaten het mogelijk om nauwkeurige kenmerken (bijv. topografieën) op micro- en nanoniveau te creëren, die dienen als mesoscopische aanwijzingen om de omringende cellulaire structuur en weefselarchitectuur op macroniveau18,20, 21,22 te verbeteren voor verschillende toepassingen in weefselregeneratie en ziektemodellering.

We hebben eerder de ontwikkeling aangetoond van een nieuw 3D-hartweefsel on-chip model dat oppervlaktetopografie bevat, in de vorm van aangeboren elliptische microposten, om hydrogelgekapte co-gekweekte hartcellen uit te lijnen in een onderling verbonden, anisotropisch weefsel20. Na 14 dagen kweek zijn de weefsels gevormd in het microfluïdische apparaat volwassener in hun fenotype, genexpressieprofiel, calciumbehandelingskenmerken en farmaceutische respons in vergelijking met monolaag en 3D-isotrope controles23. Het hierin beschreven protocol beschrijft de methode voor het maken van dit 3D-co-gekweekte, uitgelijnde (d.w.z. anisotrope) menselijke hartweefsel in het microfluïdische apparaat met behulp van hiPSC-afgeleide CMs. Specifiek leggen we de methoden uit om hiPSC’s te differentiëren en te zuiveren ten opzichte van CMs, suppletie van hCFs met CMs om een gevestigde co-cultuurpopulatie te produceren, invoeging van de celpopulatie ingekapseld in de collageenhydrogel in de microfluïdische apparaten. De resulterende 3D-gemanipuleerde microweefsels zijn geschikt voor verschillende toepassingen, waaronder fundamentele biologiestudies, CVD-modellering en farmaceutische tests.

Protocol

Voer alle celbehandeling en reagensvoorbereiding uit in een bioveiligheidskabinet. Zorg ervoor dat alle oppervlakken, materialen en apparatuur die in contact komen met cellen steriel zijn (d.w.z. afspuiten met 70% ethanol). Cellen moeten worden gekweekt in een bevochtigde incubator van 37 °C, 5% CO2. Alle hiPSC-cultuur en differentiatie wordt uitgevoerd in 6-put platen. 1. Microfluïdische apparaatcreatie (geschatte duur: 1 week) FotolithografieOPMER…

Representative Results

Om een sterk gezuiverde populatie CMs van hiPSC’s te verkrijgen, wordt een aangepaste versie gebruikt met een combinatie van het Lian differentiatieprotocol33 en Tohyama zuiveringsstappen34 (zie figuur 1A voor experimentele tijdlijn). De hiPSC’s moeten kolonieachtig zijn, ~85% samenvloeiend en zich 3-4 dagen na passage gelijkmatig over de cultuur verspreiden, bij het begin van CM-differentiatie (Figuur 1B). Specifi…

Discussion

De vorming van een in vitro menselijk hartweefselmodel met verbeterde celcelinteracties en biomimetische 3D-structuur is noodzakelijk voor fundamenteel cardiovasculair onderzoek en overeenkomstige klinische toepassingen1. Dit geschetste protocol verklaart de ontwikkeling van 3D humaan anisotroop hartweefsel in een microfluïdisch apparaat, met behulp van co-cultuur van stamcel-afgeleide CMs met bindweefsel CB’s ingekapseld in een collageenhydrogel, die dienen om de complexe celsamenstelli…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

We willen NSF CAREER Award #1653193, Arizona Biomedical Research Commission (ABRC) New Investigator Award (ADHS18-198872) en de Flinn Foundation Award bedanken voor het verstrekken van financieringsbronnen voor dit project. De hiPSC-lijn, SCVI20, werd verkregen van Joseph C. Wu, MD, PhD aan het Stanford Cardiovascular Institute gefinancierd door NIH R24 HL117756. De hiPSC-lijn, IMR90-4, werd verkregen van WiCell Research Institute55,56.

Materials

0.65 mL centrifuge tubes VWR 87003-290
1 mm Biopsy punch VWR 95039-090
1.5 mm Biopsy punch VWR 95039-088
15 mL Falcon tubes VWR 89039-670
18x18mm coverslips VWR 16004-308 The coverslips should be No.1, to allow for high magnification imaging
4% paraformaldehyde ThermoFisher 101176-014
6-well flat botttom tissue-culture plates VWR 82050-844
B27 minus insulin LifeTech A1895602
B27 plus insulin LifeTech 17504001
CHIR99021 VWR 10188-030
Collagen I, rat tail Corning 47747-218
DMEM F12 ThermoFisher 11330057
DPBS ThermoFisher 21600069
E8 ThermoFisher A1517001 can also be made in house
EDTA VWR 45001-122
Ethanol
FGM3 VWR 10172-048
GFR-Matrigel VWR 47743-718
Glycine Sigma G8898-500G
Goat serum VWR 10152-212
hESC-Matrigel Corning BD354277
IPA
IWP2 Sigma I0536-5MG
Kimwipes VWR 82003-820
MTCS Sigma 440299-1L
NaN3 Sigma S2002-25G
NaOH Sigma S5881-500G
Pen/Strep VWR 15140122
Petri dish (150x15mm) VWR 25384-326
Petri dish (60x15mm) VWR 25384-092
Phenol Red Sigma P3532-5G
RPMI 1640 ThermoFisher MT10040CM
RPMI 1640 minus glucose VWR 45001-110
Silicon Wafers (100mm) University Wafer 1196
Sodium lactate Sigma L4263-100ML
SU8 2075 Microchem Y111074 0500L1GL
SU8 Developer ThermoFisher NC9901158
Sylgard Elastomer Essex Brownell DC-184-1.1
T75 flasks VWR 82050-856
Triton X-100 Sigma T8787-100ML
TrypLE ThermoFisher 12604021
Trypsin-EDTA (0.5%) ThermoFisher 15400054
Tween20 Sigma P9416-50ML
Y-27632 Stem Cell Technologies 72304
EVG620 Aligner EVG
Plasma cleaner PDC-32G Harrick Plasma
Zeiss AxioObserver Z1 microscope Nikon
Leica SP8 Confocal microscope Leica
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Savoji, H., et al. Cardiovascular disease models: A game changing paradigm in drug discovery and screening. Biomaterials. 198, 3-26 (2019).
  2. Patino-Guerrero, A., Veldhuizen, J., Zhu, W., Migrino, R. Q., Nikkhah, M. Three-dimensional scaffold-free microtissues engineered for cardiac repair. Journal of Materials Chemistry B. 8, 7571-7590 (2020).
  3. Breslin, S., O’Driscoll, L. Three-dimensional cell culture: the missing link in drug discovery. Drug Discovery Today. 18, 240-249 (2013).
  4. Pontes Soares, C., et al. 2D and 3D-organized cardiac cells shows differences in cellular morphology, adhesion junctions, presence of myofibrils and protein expression. PLoS One. 7, 38147 (2012).
  5. Jensen, C., Teng, Y. Is it time to start transitioning from 2d to 3d cell culture. Frontiers in Molecular Biosciences. 7, 00033 (2020).
  6. Pinto, A. R., et al. Revisiting cardiac cellular composition. Circulation Research. 118, 400-409 (2016).
  7. LeGrice, I., Pope, A., Smaill, B. . Interstitial Fibrosis in Heart Failure. 253, 3-21 (2005).
  8. Veldhuizen, J., Migrino, R. Q., Nikkhah, M. Three-dimensional microengineered models of human cardiac diseases. Journal of Biological Engineering. 13, 29 (2019).
  9. Agarwal, A., Goss, J. A., Cho, A., McCain, M. L., Parker, K. K. Microfluidic heart on a chip for higher throughput pharmacological studies. Lab Chip. 13, 3599-3608 (2013).
  10. Schaaf, S., et al. Human engineered heart tissue as a versatile tool in basic research and preclinical toxicology. PLoS One. 6, 26397 (2011).
  11. Zhang, D., et al. Tissue-engineered cardiac patch for advanced functional maturation of human ESC-derived cardiomyocytes. Biomaterials. 34, 5813-5820 (2013).
  12. Rao, C., et al. The effect of microgrooved culture substrates on calcium cycling of cardiac myocytes derived from human induced pluripotent stem cells. Biomaterials. 34, 2399-2411 (2013).
  13. Navaei, A., et al. Electrically conductive hydrogel-based micro-topographies for the development of organized cardiac tissues. RSC Advances. 7, 3302-3312 (2017).
  14. Jiang, Y., Park, P., Hong, S. M., Ban, K. Maturation of cardiomyocytes derived from human pluripotent stem cells: Current strategies and limitations. Molecules and Cells. 41, 613-621 (2018).
  15. Yang, X., Pabon, L., Murry, C. E. Engineering adolescence maturation of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Circulation Research. 114, 511-523 (2014).
  16. Kharaziha, M., Memic, A., Akbari, M., Brafman, D. A., Nikkhah, M. Nano-enabled approaches for stem cell-based cardiac tissue engineering. Advanced Healthcare Materials. 5, 1533-1553 (2016).
  17. Ellis, B. W., Acun, A., Can, U. I., Zorlutuna, P. Human iPSC-derived myocardium-on-chip with capillary-like flow for personalized medicine. Biomicrofluidics. 11, 024105 (2017).
  18. Mathur, A., et al. Human iPSC-based cardiac microphysiological system for drug screening applications. Scientific Reports. 5, 8883 (2015).
  19. Mastikhina, O., et al. Human cardiac fibrosis-on-a-chip model recapitulates disease hallmarks and can serve as a platform for drug testing. Biomaterials. 233, 119741 (2020).
  20. Veldhuizen, J., Cutts, J., Brafman, D. A., Migrino, R. Q., Nikkhah, M. Engineering anisotropic human stem cell-derived three-dimensional cardiac tissue on-a-chip. Biomaterials. 256, 120195 (2020).
  21. Truong, D., et al. Human organotypic microfluidic tumor model permits investigation of the interplay between patient-derived fibroblasts and breast cancer cells. 癌症研究. 7, 3139-3151 (2019).
  22. Benam, K. H., et al. Engineered in vitro disease models. Annual Review of Pathology: Mechanisms of Disease. 10, 195-262 (2015).
  23. Karamanova, N., et al. Endothelial immune activation by medin: Potential role in cerebrovascular disease and reversal by monosialoganglioside-containing nanoliposomes. Journal of the American Heart Association. 9, 014810 (2020).
  24. Chen, G., et al. Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture. Nature Methods. 8, 424-429 (2011).
  25. Watanabe, K., et al. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 25, 681-686 (2007).
  26. Narsinh, K. H., et al. Single cell transcriptional profiling reveals heterogeneity of human induced pluripotent stem cells. Journal of Clinical Investigation. 121, 1217-1221 (2011).
  27. Cahan, P., Daley, G. Q. Origins and implications of pluripotent stem cell variability and heterogeneity. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14, 357-368 (2013).
  28. Laco, F., et al. Unraveling the inconsistencies of cardiac differentiation efficiency induced by GSKB inhibitor CHIR99021 in human pluripotent stem cells. Stem Cell Reports. 10, (2018).
  29. Rupert, C. E., Kim, T. Y., Choi, B. R., Coulombe, K. L. K. Human cardiac fibroblast number and activation state modulate electromechanical function of hiPSC-cardiomyocytes in engineered myocardium. Stem Cells International. 2020, 9363809 (2020).
  30. Ban, K., Bae, S., Yoon, Y. S. Current strategies and challenges for purification of cardiomyocytes derived from human pluripotent stem cells. Theranostics. 7, 2067-2077 (2017).
  31. Uosaki, H., et al. Efficient and scalable purification of cardiomyocytes from human embryonic and induced pluripotent stem cells by VCAM1 surface expression. PLoS One. 6, 23657 (2011).
  32. Dubois, N. C., et al. SIRPA is a specific cell-surface marker for isolating cardiomyocytes derived from human pluripotent stem cells. Nature Biotechnology. 29, 1011-1082 (2011).
  33. Lian, X., et al. Directed cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells by modulating Wnt/β-catenin signaling under fully defined conditions. Nature Protocols. 8, (2013).
  34. Tohyama, S., et al. Distinct metabolic flow enables large-scale purification of mouse and human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Cell Stem Cell. 12, 127-137 (2013).
  35. Burridge, P. W., Keller, G., Gold, J. D., Wu, J. C. Production of de novo cardiomyocytes: human pluripotent stem cell differentiation and direct reprogramming. Cell Stem Cell. 10, 16-28 (2012).
  36. Mummery, C. L., et al. Differentiation of human embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells to cardiomyocytes: a methods overview. Circulation Research. 111, 344-358 (2012).
  37. Radisic, M., et al. Biomimetic approach to cardiac tissue engineering. Philosophical Transactions of the Royal Society of London B Biological Science. 362, 1357-1368 (2007).
  38. Hulsmans, M., et al. Macrophages facilitate electrical conduction in the heart. Cell. 169, 510-522 (2017).
  39. Frantz, S., Nahrendorf, M. Cardiac macrophages and their role in ischaemic heart disease. Cardiovascular Research. 102, (2014).
  40. Truong, D., et al. A three-dimensional (3D) organotypic microfluidic model for glioma stem cells – Vascular interactions. Biomaterials. 198, 63-77 (2019).
  41. Shao, J., et al. Integrated microfluidic chip for endothelial cells culture and analysis exposed to a pulsatile and oscillatory shear stress. Lab Chip. 9, 3118-3125 (2009).
  42. Leclerc, E., Sakai, Y., Fujii, T. Cell culture in 3-dimensional microfluidic structure of PDMS (polydimethylsiloxane). Biomedical Microdevices. 5, 109-114 (2003).
  43. Mukhopadhyay, R. When PDMS isn’t the best. What are its weaknesses, and which other polymers can researchers add to their toolboxes. Analytical Chemistry. 79, 3248-3253 (2007).
  44. van Meer, B. J., et al. Small molecule absorption by PDMS in the context of drug response bioassays. Biochemical and Biophysical Research Communication. 482, 323-328 (2017).
  45. Berthier, E., Young, E. W., Beebe, D. Engineers are from PDMS-land, Biologists are from Polystyrenia. Lab Chip. 12, 1224-1237 (2012).
  46. Chuchuy, J., et al. Integration of electrospun membranes into low-absorption thermoplastic organ-on-chip. ACS Biomaterials Science & Engineering. , (2021).
  47. Soucy, J. R., et al. Reconfigurable microphysiological systems for modeling innervation and multitissue interactions. Advanced Biosystems. 4, 2000133 (2020).
  48. Cutts, J., Nikkhah, M., Brafman, D. A. Biomaterial approaches for stem cell-based myocardial tissue engineering. Biomarker Insights. 10, 77-90 (2015).
  49. Navaei, A., et al. Gold nanorod-incorporated gelatin-based conductive hydrogels for engineering cardiac tissue constructs. Acta Biomaterialia. 41, 133-146 (2016).
  50. Navaei, A., et al. The influence of electrically conductive and non-conductive nanocomposite scaffolds on the maturation and excitability of engineered cardiac tissues. Biomaterial Sciences. 7, 585-595 (2019).
  51. Saini, H., Navaei, A., Van Putten, A., Nikkhah, M. 3D cardiac microtissues encapsulated with the co-culture of cardiomyocytes and cardiac fibroblasts. Advanced Healthcare Materials. 4, 1961-1971 (2015).
  52. Shadrin, I. Y., et al. Cardiopatch platform enables maturation and scale-up of human pluripotent stem cell-derived engineered heart tissues. Nature Communications. 8, 1825 (2017).
  53. Ronaldson-Bouchard, K., et al. Advanced maturation of human cardiac tissue grown from pluripotent stem cells. Nature. 556, 239-243 (2018).
  54. Perl, A., Reinhoudt, D. N., Huskens, J. Microcontact Printing: Limitations and Achievements. Advanced Materials. 21, 2257-2268 (2009).
  55. Yu, J., et al. Human induced pluripotent stem cells free of vector and transgene sequences. Science. 324, 797-801 (2009).
  56. Yu, J., et al. Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. Science. 318, 1917-1920 (2007).

Tags

Microfluidic PlatformCardiovascular DiseaseMyocardiumStem Cell-derived CardiomyocytesCardiac FibroblastsCell DissociationCell CultureCell Alignment

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Veldhuizen, J., Nikkhah, M. Developing 3D Organized Human Cardiac Tissue within a Microfluidic Platform. J. Vis. Exp. (172), e62539, doi:10.3791/62539 (2021).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image