تحميل حبة يدخل البروتينات، البلازميدات، والجسيمات في خلايا الثدييات الملتصقة. تقنية تحميل الخلايا هذه غير مكلفة وسريعة ولا تؤثر بشكل كبير على صحة الخلية. وهو الأنسب للتصوير بالخلايا الحية.
تستخدم العديد من تجارب التصوير بالخلايا الحية جزيئات خارجية (مثل الببتيدات والأجسام المضادة والخرز) لتسمية الخلايا أو عملها داخلها. ومع ذلك ، فإن إدخال البروتينات إلى خلية عبر غشاءها أمر صعب. إن الاختيار المحدود للطرق الحالية يتصارع مع انخفاض الكفاءة، ويتطلب معدات مكلفة وصعبة تقنيا، أو وظائف ضمن معايير ضيقة. هنا، نقوم بوصف تقنية بسيطة نسبيا وفعالة من حيث التكلفة لتحميل الحمض النووي، الحمض النووي الريبي، والبروتينات في الخلايا البشرية الحية. يؤدي تحميل الخرز إلى اضطراب ميكانيكي مؤقت في غشاء الخلية ، مما يسمح للجزيئات الكبيرة بدخول خلايا الثدييات الحية الملتصقة. في أقل من 0.01 دولار أمريكي لكل تجربة ، تحميل الخرز هو أقل طريقة تحميل الخلايا تكلفة المتاحة. وعلاوة على ذلك، تحميل حبة لا يضغط بشكل كبير الخلايا أو تؤثر على قدرتها على البقاء أو الانتشار. تصف هذه المخطوطة خطوات إجراء تحميل الخرز، والتعديلات، والاختلافات، والقيود التقنية. هذه المنهجية مناسبة بشكل خاص للتصوير بالخلايا الحية ولكنها توفر حلا عمليا للتطبيقات الأخرى التي تتطلب إدخال البروتينات أو الخرز أو الحمض النووي الريبي أو البلازميدات في خلايا الثدييات الحية الملتصقة.
تحميل الجزيئات الكبيرة في خلايا الثدييات يتطلب منهجية تسمح لهم بعبور غشاء البلازما في الخلية1. يمكن أن تدخل عدة طرق البلازميدات في خلايا الثدييات من خلال العدوى ، بما في ذلك العدوى الليبوسومالية2 وتغذية ديثيلامينوثيل ديكتران3. ومع ذلك، فإن طرق تحميل البروتينات أو الجسيمات غير القابلة للغشاء إلى خلايا أكثر محدودية.
وقد تجاوزت عدة تقنيات هذه العقبة الصعبة باستخدام استراتيجيات مختلفة. أولا، microinjection يسلم الجسيمات من خلال micropipette في الخلايا الحية تحت المجهر4. في حين يمكن القول إن الطريقة الأكثر سيطرة وأقل الغازية، وهذه التقنية هي منخفضة نسبيا الإنتاجية لأنه يجب تحميل الخلايا واحدا تلو الآخر. وعلاوة على ذلك، يتطلب الميكروية معدات متخصصة وهو أمر صعب من الناحية التقنية.
ثانيا، الإلكتروبوين هو وسيلة لحقن البروتينات الكهربائية في الخلايا عن طريق تعطيل الغشاء الناجم عن الجهد5،6،7. ومع ذلك ، فإن هذه الطريقة تتطلب مرة أخرى معدات متخصصة ومكلفة ، ويمكن أن تسبب الصدمة إجهاد الخلايا والوفيات. علاوة على ذلك ، يجب أن يتم تجريب الخلايا قبل الكهربوجين وإعادة طلاءها لاحقا ، مما يحد من الإطار الزمني الذي يمكن فيه فحص الخلايا بعد الكهربوجين.
ثالثا، قد يتم تعديل أغشية الخلايا كيميائيا للارتهان المؤقت القابل للعكس8،9. يدخل تحميل العقدية-O السموم الداخلية في أغشية الخلايا ، والتي تشكل مساما مؤقتة ، مما يسمح للجسيمات الخارجية الغشاء غير نفاذية ، بما في ذلك البروتينات وبلازميدات الحمض النووي ، بدخول الخلايا10. بعد 2 ساعة الانتعاش، حوالي نصف الخلايا إصلاح هذه المسام ووقف استيعاب الجسيمات من الحل. ومع ذلك، تتطلب هذه التقنية وقتا طويلا للتعافي ولا تتوافق مع أنواع الخلايا التي لا يمكنها تحمل السموم الداخلية.
رابعا، يقوم التعطيل الميكانيكي بتحميل الجسيمات في الخلايا من خلال الاضطراب المادي لغشاء الخلية11. ويمكن القيام بذلك بطرق متعددة، بما في ذلك الخدش، كشط، والمتداول الخرز فوق الخلايا12،13. في وقت مبكر من عام 1987 ، تم استخدام الخرز لتحميل البروتينات في الخلايا ميكانيكيا14. في الآونة الأخيرة ، تم تحسين تقنية تحميل الخرز وتكييفها خارج البروتينات لتشمل تحميل البلازميدات والحمض النووي الريبي ، كما هو موضح هنا.
تحميل الخرز هو وسيلة سهلة وغير مكلفة وسريعة لتحميل البروتين وplasmids في الخلايا البشرية الملتصقة. يتم لف الخرز الزجاجي لفترة وجيزة فوق الخلايا ، مما يعطل غشاءها الخلوي مؤقتا. وهذا يسمح للجسيمات في الحل للدخول. كما تحميل حبة لديه كفاءة منخفضة، هو الأنسب لتجارب المجهر جزيء واحد أو خلية واحدة. تحميل حبة يمكن أن أعرض مجموعة واسعة من البروتينات، بما في ذلك الأجسام المضادة مجزأة (فاب)،15،16 البروتينات النقية مثل scFvs،17 داخل الجسم،18،19،أو بروتينات معطف مرنا، على سبيل المثال، MS2 معطف البروتين (MCP)20،21. ويمكن أيضا أن تضاف ناقلات التعبير البلازميد إلى محلول البروتين والخرز محملة في وقت واحد22،23،24،25.
ما وراء البروتينات وplasmids، جزيئات كبيرة مثل 250 نانومتر حبات البوليسترين وقد أدخلت في الخلايا عن طريق تحميل حبة (الاتصالات الشخصية). تحميل حبة غير مكلفة بشكل لا يصدق، وتكلف أقل من 0.01 دولار أمريكي لكل تجربة في المواد والتي لا تتطلب معدات إضافية باهظة الثمن. يتم تقليل التكلفة بشكل أكبر عن طريق تقليل كمية المسابير المستخدمة في التجربة الواحدة لأنه يتم تحميل الخلايا فقط في الميكروويل المركزي الذي يبلغ قطره 14 مم في غرفة التصوير. وتجدر الإشارة إلى أن منطقة التحميل المحدودة تعني أن تحميل الخرز ليس مثاليا لتحميل الخلايا السائبة.
تعرض هذه المخطوطة عملية تحميل الخرز، بما في ذلك كيفية بناء جهاز تحميل الخرز وإجراء تجربة. ويظهر أن البروتينات والحمض النووي الريبي والحمض النووي يمكن تحميلها في أنواع مختلفة من الخلايا وأن اثنين من البروتينات المختلفة المحملة بالخرز في وقت واحد لديهما تركيزات خلوية مترابطة للغاية وتباين منخفض نسبيا. كما نوقشت الاختلافات في البروتوكول على أساس نوع الخلية وتحميل البروتين، البلازميد، أو الحمض النووي الريبي. على الرغم من أنه يعتقد أن الخرز يثقب ويعطل غشاء الخلية ، عند تنفيذه بشكل مناسب ، فإن عملية تحميل الخرز لا تطرد سوى عدد قليل من الخلايا من أسفل غرفة التصوير. بعد فترة نقاهة قصيرة، تستمر الخلايا في النمو والانقسام. هذه المنهجية مثالية لتجارب المجهر الخلية الحية، بما في ذلك البروتين جزيء واحد وتتبع الحمض النووي الريبي، والكشف عن تعديل ما بعد الترجمة، ومراقبة الآليات الخلوية الديناميكية، أو رصد توطين دونالخلوية 15،16،22،26،27.
تقنية تحميل الخرز الموصوفة هنا هي طريقة فعالة من حيث التكلفة وفعالة من حيث الوقت لإدخال الجزيئات الكبيرة وغيرها من الجسيمات في الخلايا الملتصقة. هذه العملية تنوعا يمكن تحميل البروتين (الشكل 2A)15،16،26،27، مزيج من البروتين وplasmids ( الشكل2B،C)22،25، RNA ( الشكل4C) ، 100 و 250 نانومتر البوليسترين الخرز (المراسلات الشخصية) ، والأصباغ الاصطناعية39 أو نقاط الكم34،400 نانومتر . قد يكون تحميل حبة القدرة على تحميل أنواع أخرى من الجسيمات الغشاء غير منفذة كذلك. التطبيق الأكثر استخداما هو لتحميل الأجسام المضادة أو فابس لاستهداف epitopes الذاتية، مثل التعديلات ما بعد الترجمة (PTMs)، في الخلايا الحية. الأهداف، مثل PTMs، غالبا ما يكون من الصعب تسمية في الخلايا الحية دون تحديد PTM محددة، المجسات المشفرة وراثيا41،42. في المقابل ، يمكن تحميل حبة إدخال أنواع متعددة من المسابير ، والمراسلين ، أو غيرها من الأدوات الجزيئية معا في نفس الخلية لرصد قراءات متعددة في وقت واحد. نتوقع أن يكون تحميل الخرز تقنية مفيدة لتحميل مجموعة متنوعة من الجزيئات أو الجسيمات الكبيرة.
ميزة رئيسية لتحميل حبة هو انخفاض التكلفة: كل تجربة تكاليف أقل من 0.01 USD. ويمكن إجراء جهاز محمل حبة بسهولة باستخدام مواد غير مكلفة تكلف في المجموع ~ 150 دولارا ، وهو أقل تكلفة بكثير من أي طريقة أخرى لتحميل الخلايا. يمكن تخفيض تكلفة جهاز محمل الخرز إلى أقل من 10 دولارات عن طريق استبدال الغرفة المعدنية القابلة لإعادة الاستخدام بأخرى بلاستيكية. لهذا، إما حفر حفرة في غرفة 35 ملم أو إزالة الزجاج من غرفة 35 ملم الزجاج القاع، ثم ربط شبكة بأمان في مكان مع الشريط. بدلا من جهاز، يمكن حتى تحميل حبة يمكن القيام به باستخدام واسعة تتحمل 1000 ميكرولتر ماصة تلميح لغرف ورش الخرز على الخلايا، على الرغم من أن هذا الاختلاف يجعل من الصعب رش طبقة واحدة من الخرز على الخلايا (الخطوة 4.6).
فائدة أخرى لتحميل حبة هو أن الخلايا يمكن أن تحتفظ مورفولوجيا العام العادي، يتعافى بسرعة، والاستمرار في النمو والانقسام، على الأقل لخلايا U2OS، RPE1، وهيلا درس هنا ولخطوط الخلية الأخرى درس في مكان آخر (الشكل 3؛ الشكل 4 ألف، باء ؛ فيديو تكميلي 1؛ والجدول 1)31. أثناء تحميل الخرز ، تخضع الخلايا للإجهاد البدني وأحيانا تزيح وتقشر (~ 5٪ من الخلايا تقشر في ظل الظروف المثلى ، ولكن يمكن أن يحدث فقدان أكبر للخلية إذا تم تحميل الخرز بقوة كبيرة جدا أو يتم تحميل الكثير من الخرز الزجاجي فوق الخلايا ، كما هو موضح في الشكل 3B). ومع ذلك، عادة ما تظهر الخلايا المحملة بالخرز التي تظل متصلة بالقطعة الأغطية صحية ويمكن تصويرها في أقرب وقت 30 دقيقة بعد تحميل الخرز(الشكل 3A). نسمح للخلايا بشكل عام بفترة استرداد مدتها 30 دقيقة ولكن نتوقع أن يكون التصوير في وقت أقرب بعد تحميل الخرز ممكنا.
عيب رئيسي في هذه التقنية هو أن الخلايا تحتاج إلى أن تكون قادرة على تحمل الإجهاد البدني البسيط أثناء التحميل وتبقى ملتزمة بشكل آمن بالزلاقة. خطوط الخلايا سيئة / غير الملتصقة أو الخلايا التي تزرع على لوحات مغلفة (على سبيل المثال، HEK والخلايا الجذعية) غالبا ما تنفصل عند التنصت لطيف أثناء تحميل حبة. علاوة على ذلك، أظهرت التجربة أن الخلايا العصبية الأولية حساسة جدا لتحميل الخرز.
تحميل حبة هو الأنسب للتجارب وحيد الخلية أو جزيء واحد. في تجربتنا، تحميل حبة لديه ما يقرب من 20-40٪ كفاءة تحميل البروتين، و ~ 20٪ من الخلايا المحملة بالخرز وأعرب أيضا عن بلازميد محملة المشاركة (الشكل 2A،B). وهكذا، قد يكون تحميل الخرز البلازميدات أقل كفاءة للتعبير عن البروتين من حبة تحميل البروتينات المنقى لأن البلازميدات يجب أن لا تدخل الخلايا فقط ولكن أيضا أن أعرب (الذي ينطوي، من بين أمور أخرى، استيراد النووية، والنسخ، والترجمة، كل منها يمكن أن تقلل من كفاءة التعبير). يمكن التحايل على الكفاءة المنخفضة للتعبير البلازميد المحمل بالخرز باستخدام بروتوكولات العدوى البديلة ، مثل شفط الدهون ، قبل تحميل حبة البروتينات أو المسابير16،27. بالإضافة إلى ذلك، قد تساعد احتضان الخلايا في الوسائط المثلى لمدة 30 دقيقة قبل تحميل الخرز في التعبير البلازميد. بسبب انخفاض تعبير البلازميد ، لم يتم استخدام تحميل الخرز في كثير من الأحيان كبديل لإصابة العدوى القائمة على شفط الدهون في هذا المختبر. الاستثناء الوحيد هو عندما البروتين المنقى، مثل فاب، هو أن تكون محملة مشتركة، وفي هذه الحالة هو مريح جدا لتحميل حبة البروتين وبلازميد في نفس الوقت. وعلاوة على ذلك، بالنسبة للخلايا التي لا تستجيب أو غير متسامحة مع شفط الدهون، قد يوفر تحميل الخرز طريقة بديلة، وإن كانت منخفضة الكفاءة، للتعبير البلازميد العابر.
The authors have nothing to disclose.
ونحن ممتنون لأعضاء مختبر ستاسيفيتش على المحادثات التي لا حصر لها التي ساعدت على تحسين وتطوير هذا البروتوكول. على وجه التحديد، الدكتور ليندا فوردو والدكتور فوكس للحصول على المشورة بشأن حبة تحميل أنواع مختلفة من الخلايا. ونود أن نشكر بإخلاص الدكتور يوكو هاياشي – تاكاناكا، والدكتور يوكو ساتو، والدكتور هيروشي كيمورا على تقاسم بروتوكول تحميل الخرز الزجاجي. نحن ممتنون جدا للدكتور أشوك براساد والدكتور دييغو كرابف لتقاسم بسخاء بروتوكولات تحميل الخرز لإدخال الجسيمات غير العضوية في الخلايا. ونحن ممتنون للدكتور ترافيس ساندرز، كريغ مارشال، والدكتور توماس سانتانجيلو لتقاسم بسخاء كاشف الحمض النووي الريبي المسمى. تم دعم ALK و MNS و CAC و GG و TJS من قبل منحة المعاهد الوطنية للصحة R35GM119728 ومنحة المؤسسة الوطنية للعلوم (NSF) المهنية MCB-1845761 ، وكلاهما إلى TJS. كما تم دعم CAC من قبل NRT NRT NSF جائزة DGE-1450032.
10 cm cell culture dishes | VWR | 82050-916 | Use to culture cells |
35 mm cell culture dishes | Falcon | 353001 | Use to construct bead loader |
Attofluor Cell Chamber | Thermo Fisher Scientific | A7816 | Use to construct the custom bead loader |
DMEM, high glucose, no glutamine | Thermo Fisher Scientific | 11960069 | Use in general cell culture |
Drierite Indicating Absorbents | Thermo Fisher Scientific | 07-578-3B | Store the bead loader in a desiccator with these absorbent pellets |
Fetal Bovine Serum | Atlas Biologics | F-0050-A | Use in general cell culture and as a supplement before bead loading |
Glass beads, acid washed, ≤106 µm* | Millipore Sigma | G4649 | Sprinkle on cells to bead load plasmid DNA and proteins |
Glass bottom dishes, 35 mm, #1.5, 14 mm glass | MatTek Corporation | P35G-1.5-14-C | Seed cells onto these chambers for imaging |
L-Glutamine-200 mM | Thermo Fisher Scientific | 25030081 | Use to make DMEM + media |
Opti-MEM, Reduced Serum Medium | Thermo Fisher Scientific | 31985070 | Optimal media for incubating cells before bead loading (optional step) |
Parafilm | VWR | 52858-032 | waxy film used to construct bead loader |
Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | Use to make DMEM + media |
Phenol-free DMEM | Thermo Fisher Scientific | 31053036 | Use on cells before imaging |
Phosphate Buffered Saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific | AM9625 | Working stock of sterile 1X PBS |
Sodium Hydroxide (NaOH) | Thermo Fisher Scientific | S318-500 | Use 2 M solution to wash glass beads |
Spectra Mesh Woven Filters, Polypropylene, 105 µm opening | Spectrum Labs | 148496 | Use to construct bead loader |
Trypsin | Thermo Fisher Scientific | 25300062 | Use in general cell culture |