Использование базового покрытия и минископа Preanchored с объективом для исследования переходных процессов кальция на мышах
Summary
Усадка зубного цемента во время отверждения смещает опорную плиту. Этот протокол минимизирует проблему, создавая первоначальный фундамент из зубного цемента, который оставляет место для цементирования опорной плиты. Несколько недель спустя опорная плита может быть зацементирована в положении на этом каркасе с использованием небольшого количества нового цемента, тем самым уменьшая усадку.
Abstract
Нейробиологи используют миниатюрные микроскопы (минископы) для наблюдения активности нейронов у свободно ведущих себя животных. Команда Miniscope Калифорнийского университета в Лос-Анджелесе (UCLA) предоставляет открытые ресурсы для исследователей для создания минископов самостоятельно. Минископ V3 UCLA является одним из самых популярных минископов с открытым исходным кодом, используемых в настоящее время. Он позволяет визуализировать флуоресцентные переходные процессы, испускаемые генетически модифицированными нейронами, через объективную линзу, имплантированную в поверхностную кору (система с одной линзой), или в глубокие области мозга через комбинацию релейной линзы, имплантированной в глубокий мозг, и объектива, который предварительно отбирается в минископе для наблюдения за ретранслируемым изображением (двухлинзовая система). Даже в оптимальных условиях (когда нейроны выражают показатели флуоресценции и правильно имплантирована релейная линза) изменение объема зубного цемента между опорной пластиной и его прикреплением к черепу при отверждении цемента может вызвать смещение с измененным расстоянием между объективом и релейными линзами, что приводит к ухудшению качества изображения. Опорная плита – это пластина, которая помогает установить минископ на череп и фиксирует рабочее расстояние между объективом и релейными линзами. Таким образом, изменения в объеме зубного цемента вокруг опорной пластины изменяют расстояние между линзами. Настоящий протокол направлен на минимизацию проблемы смещения, вызванной изменениями объема зубного цемента. Протокол уменьшает перекос, создавая первоначальный фундамент из зубного цемента во время имплантации релейной линзы. Время выздоровления после имплантации достаточно для того, чтобы фундамент зубного цемента полностью отверзил опорную плиту, поэтому опорную плиту можно цементировать на этом каркасе, используя как можно меньше нового цемента. В настоящей статье мы описываем стратегии нанесения базовых покрытий у мышей, чтобы обеспечить визуализацию нейронной активности с помощью объектива, закрепленного в минископе.
Introduction
Флуоресцентные репортеры активности идеально подходят для визуализации активности нейронов, поскольку они чувствительны и имеют большие динамические диапазоны 1,2,3. Поэтому все большее число экспериментов используют флуоресцентную микроскопию для непосредственного наблюдения активности нейронов 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15 ,16. Первый миниатюрный однофотонный флуоресцентный микроскоп (минископ) был разработан в 2011 году Марком Шнитцером и др.5. Этот минископ позволяет исследователям контролировать динамику флуоресценции мозжечковых клеток у свободно ведущих себя животных5 (т.е. без каких-либо физических ограничений, подголовника, седации или анестезии животных). В настоящее время методика может применяться для мониторинга поверхностных участков мозга, таких как кора 6,8,15,16; подкорковые области, такие как спинной гиппокамп 8,11,13,14 и полосатое тело 6,17; и глубокие области мозга, такие как вентральный гиппокамп14, миндалина 10,18 и гипоталамус 8,12.
В последние годы было разработано несколько минископов с открытым исходным кодом.4,5,6,7,11,13,17,19. Минископ может быть экономически собран исследователями, если они следуют пошаговым рекомендациям, предоставленным командой Miniscope Калифорнийского университета в Лос-Анджелесе (UCLA).4,7,11,13. Потому что оптический мониторинг нейронной активности ограничен ограничениями светопропускания7 Для и из интересующей нейронной популяции был разработан минископ, который требует, чтобы объектив с градиентным показателем преломления (GRIN) (или объектив) был предварительно отобран в нижней части минископа для увеличения поля зрения, которое передается из релейной линзы GRIN (или релейной линзы)6,7,8,10,16,17. Эта релейная линза имплантируется в целевую область мозга таким образом, что флуоресцентная активность целевой области мозга передается на поверхность релейной линзы.6,7,8,10,16,17. Приблизительно 1/4 полного синусоидального периода света проходит через объектив GRIN (~ 0,25 шага) (Рисунок 1A1), что приводит к увеличенному флуоресцентному изображению6,7. Объектив не всегда фиксируется в нижней части минископа, и не требуется имплантация релейной линзы6,7,11,13,15. В частности, существует две конфигурации: одна с фиксированным объективом в минископе и релейная линза, имплантированная в мозг.8,10,12,14,16 (Рисунок 1B1) и еще один со съемным объективом6,7,11,13,15 (Рисунок 1B2). В конструкции, основанной на комбинации неподвижного объектива и имплантированной релейной линзы, флуоресцентные сигналы от мозга доводятся до верхней поверхности релейной линзы (Рисунок 1A1)7,8,10,12,14,16. Впоследствии объектив может увеличивать и передавать поле зрения с верхней поверхности релейной линзы (Рисунок 1A2). С другой стороны, конструкция съемной объектива GRIN более гибкая, что означает, что предварительная имплантация релейной линзы в мозг не является обязательной (Рисунок 1B2)6,7,11,13,15. При использовании минископа, основанного на конструкции съемной объективной линзы, исследователям все еще необходимо имплантировать линзу в целевую область мозга, но они могут либо имплантировать объективную линзу.6,7,11,13,15 или релейная линза в головном мозге6,7. Выбор объектива или релейной линзы для имплантации определяет конфигурацию минископа, которую должен использовать исследователь. Например, минископ V3 UCLA основан на съемной конструкции объектива GRIN. Исследователи могут выбрать либо прямую имплантацию объектива в интересующую область мозга, либо установить «пустой» минископ на объектив.6,7,11,13,15 (однообъективная система; Рисунок 1B2) или имплантировать релейную линзу в мозг и установить минископ, который предварительно отобран с объективом6,7 (двухобъективная система; Рисунок 1B1). Затем минископ работает как флуоресцентная камера для захвата прямых трансляций изображений флуоресценции нейронов, создаваемой генетически закодированным индикатором кальция.1,2,3. После подключения минископа к компьютеру эти флуоресцентные изображения могут быть переданы на компьютер и сохранены в виде видеоклипов. Исследователи могут изучать активность нейронов, анализируя относительные изменения флуоресценции с помощью некоторых пакетов анализа.20,21 или написать свои коды для будущего анализа.
Минископ V3 UCLA обеспечивает гибкость для пользователей, чтобы определить, следует ли отображать активность нейронов с помощью системы7 с одной или двумя линзами. Выбор системы записи основывается на глубине и размере целевой области мозга. Короче говоря, система с одним объективом может отображать только область, которая является поверхностной (менее примерно 2,5 мм глубиной) и относительно большой (больше, чем примерно 1,8 x 1,8мм2), потому что производители производят только определенный размер объектива. Напротив, двухлинзовая система может быть применена к любой целевой области мозга. Однако зубной цемент для склеивания опорной плиты имеет тенденцию вызывать смещение с измененным расстоянием между объективом и релейными линзами, что приводит к плохому качеству изображения. Если используется система с двумя объективами, для достижения оптимального качества изображения необходимо точно указать два рабочих расстояния (рисунок 1A). Эти два критических рабочих расстояния находятся между нейронами и нижней поверхностью релейной линзы, а также между верхней поверхностью релейной линзы и нижней поверхностью объектива (рисунок 1A1). Любое смещение или неправильное расположение объектива за пределами рабочего расстояния приводит к сбою изображения (рисунок 1C2). Напротив, система с одним объективом требует только одного точного рабочего расстояния. Однако размер объектива ограничивает его применение для мониторинга глубоких областей мозга (объектив, который подходит для минископа, составляет примерно 1,8 ~ 2,0 мм 6,11,13,15). Поэтому имплантация объектива ограничена для наблюдения за поверхностью и относительно большими областями мозга, такими как кора 6,15 и спинной cornu ammonis 1 (CA1) у мышей11,13. Кроме того, большая область коры должна быть аспирирована для нацеливания на спинную часть CA111,13. Из-за ограничения конфигурации с одной линзой, которая предотвращает визуализацию глубоких областей мозга, коммерческие системы минископов предлагают только комбинированную конструкцию объектива / релейной линзы (двухлинз). С другой стороны, минископ V3 UCLA может быть модифицирован в однообъективную или двухобъективную систему, потому что его объектив съемный 6,11,13,15. Другими словами, пользователи минископа V3 UCLA могут воспользоваться съемным хрусталиком, имплантировав его в мозг (создав систему с одной линзой), при выполнении экспериментов с участием поверхностных наблюдений за мозгом (менее 2,5 мм в глубину) или предварительно выбрав его в минископ и имплантировав релейную линзу в мозг (создав двухлинзовую систему), при выполнении экспериментов с участием глубоких наблюдений мозга. Система с двумя линзами также может быть применена для поверхностного наблюдения за мозгом, но исследователь должен знать точные рабочие расстояния между объективом и линзой реле. Основным преимуществом системы с одним объективом является то, что существует меньшая вероятность пропуска рабочих расстояний, чем в системе с двумя объективами, учитывая, что существует два рабочих расстояния, которые должны быть точно нацелены для достижения оптимального качества изображения в системе с двумя объективами (рисунок 1A). Поэтому мы рекомендуем использовать однолинзовую систему для поверхностных наблюдений за мозгом. Однако, если эксперимент требует визуализации в глубокой области мозга, исследователь должен научиться избегать смещения двух линз.
Базовый протокол двухлинзовой конфигурации минископов для экспериментов включает имплантацию линз и покрытиеоснований 8,10,16,17. Опорное покрытие – это наклеивание опорной пластины на голову животного, так что минископ может быть в конечном итоге установлен поверх животного и видеозапись флуоресцентных сигналов нейронов (рисунок 1B). Эта процедура включает в себя использование зубного цемента для приклеивания опорной пластины на череп (рисунок 1C), но усадка зубного цемента может вызвать неприемлемые изменения расстояния между имплантированной релейной линзой и объективом 8,17. Если смещенное расстояние между двумя линзами слишком велико, клетки не могут быть сфокусированы.
Подробные протоколы экспериментов по глубокой визуализации кальция мозга с использованием минископов уже опубликованы8,10,16,17. Авторы этих протоколов использовали систему Inscopix8,10,16 или другие индивидуальные проекты17 и описали экспериментальные процедуры вирусного отбора, хирургии и прикрепления опорной пластины. Однако их протоколы не могут быть точно применены к другим системам с открытым исходным кодом, таким как система V3 UCLA Miniscope, NINscope.6и финчскоп19. Смещение двух линз может произойти во время записи в конфигурации с двумя линзами с минископом UCLA из-за типа зубного цемента, который используется для цементирования опорной пластины к черепу8,17 (Рисунок 1C). Настоящий протокол необходим, поскольку расстояние между имплантированной релейной линзой и объективом склонно к смещению из-за нежелательной усадки зубного цемента во время процедуры нанесения опорного покрытия. Во время нанесения опорного покрытия оптимальное рабочее расстояние между имплантированной релейной линзой и объективом должно быть найдено путем регулировки расстояния между минископом и верхней частью релейной линзы, а затем опорная пластина должна быть приклеена в этом идеальном месте. После установки правильного расстояния между объективом и имплантированной релейной линзой можно получить продольные измерения с клеточным разрешением (Рисунок 1B; in vivo запись). Так как оптимальный диапазон рабочих расстояний релейной линзы невелик (50 – 350 мкм)4,8, чрезмерная усадка цемента во время отверждения может затруднить удержание объектива и имплантированной релейной линзы в соответствующем диапазоне. Общая цель этого отчета состоит в том, чтобы предоставить протокол для уменьшения проблем усадки8,17 которые происходят во время процедуры опорного покрытия и для увеличения успешности минископических записей флуоресцентных сигналов в конфигурации с двумя линзами. Успешная запись минископа определяется как запись прямой трансляции заметных относительных изменений флуоресценции отдельных нейронов у свободно ведущего себя животного. Хотя разные марки стоматологического цемента имеют разную скорость усадки, исследователи могут выбрать бренд, который был ранее протестирован.6,7,8,10,11,12,13,14,15,16,22. Тем не менее, не каждый бренд легко получить в некоторых странах / регионах из-за правил импорта медицинских материалов. Поэтому мы разработали методы для проверки скорости усадки доступных зубных цементов и, что важно, предоставляем альтернативный протокол, который минимизирует проблему усадки. Преимуществом по сравнению с настоящим протоколом нанесения фундамента является увеличение успешности визуализации кальция с помощью инструментов и цемента, которые можно легко получить в лабораториях. В качестве примера используется минископ UCLA, но протокол также применим к другим минископам. В этом отчете мы описываем оптимизированную процедуру нанесения опорных покрытий, а также рекомендуем некоторые стратегии установки системы минископа UCLA с двумя линзами (Рисунок 2А). Представлены как примеры успешной имплантации (n= 3 мыши), так и примеры неудачной имплантации (n=2 мыши) для двухлинзовой конфигурации с минископом UCLA вместе с обсуждениями причин успехов и неудач.
Protocol
Representative Results
Discussion
В настоящем докладе описывается подробный экспериментальный протокол для исследователей, использующих двухлинзовую систему минископа UCLA. Инструменты, разработанные в нашем протоколе, относительно доступны для любой лаборатории, которая хочет попробовать визуализацию кальция in viv…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана Министерством науки и технологий Тайваня (108-2320-B-002-074, 109-2320-B-002-023-MY2).
Materials
| 0.7-mm drill bit | #19008-07 | Fine Science Tools; USA | for surgery |
| 0.1–10 μl pipette tips | 104-Q; QSP | Fisher Scientific; Singapore | for testing dental cement |
| 20 G IV cathater | #SR-OX2032CA | Terumo Corporation; Tokyo, Japan | for surgery |
| 27 G needle | AGANI, AN*2713R | Terumo Corporation; Tokyo, Japan | for surgery |
| AAV9-syn-jGCaMP7s-WPRE | #104487-AAV9; 1.5*10^13 | Addgene viral prep; MA, USA | for viral injection |
| Atropine sulfate | Astart; Hsinchu, Taiwan | for surgery/dummy baseplating/baseplating | |
| Baseplate | V3 | http://miniscope.org | for dummy baseplating/baseplating |
| BLU TACK | #30840350 | Bostik; Chelsea, Massachusetts, USA | Reusable adhesive clay; for surgery/dummy baseplating/baseplating |
| Bone Rongeur Friedman | 13 cm | Diener; Tuttlingen, Germany | for baseplating |
| Buprenorphine | INDIVIOR; UK | for surgery | |
| Carprofen | Rimadyl | Zoetis; Exton, PA | analgesia |
| Ceftazidime | Taiwan Biotech; Taiwan | prevent infection | |
| Data Acquisition PCB for UCLA Miniscope | purchased on https://www.labmaker.org/collections/neuroscience/products/data-aquistion-system-daq | for baseplating | |
| Dental cement set | Tempron | GC Corp; Tokyo, Japan | for testing dental cement |
| Dental cement set | Tokuso Curefast | Tokuyama Dental Corp.; Tokyo, Japan | for testing dental cement/surgery/dummy baseplating/baseplating |
| Dual Lab Standard with Mouse and Rat Adaptors | #51673 | Stoelting Co; Illinois, USA | for surgery/dummy baseplating/baseplating |
| Duratear ointment | Alcon; Geneva, Switzerland | for surgery/dummy baseplating/baseplating | |
| Ibuprofen | YungShin; Taiwan | analgesia | |
| Isoflurane | Panion & BF Biotech INC.; Taoyuan, Taiwan | for surgery/dummy baseplating/baseplating | |
| Inscopix | nVista System | Inscopix; Palo Alto, CA | for comparison with V3 UCLA Miniscope |
| Ketamine | Pfizer; NY, NY | for euthanasia | |
| Normal saline | for surgery | ||
| Micro bulldog clamps | #12.102.04 | Dimedo; Tuttlingen, Germany | for lens implantation |
| Microliter Microsyringes, 2.0 µL, 25 gauge | #88400 | Hamilton; Bonaduz, Switzerland | for viral injection |
| Molding silicone rubber | ZA22 Thixo | Zhermack; Badia Polesine, Italy | for dummy baseplating |
| Objective Gradient index (GRIN) lens | #64519 | Edmund Optics; NJ, USA | for dummy baseplating/baseplating |
| Parafilm | #PM996 | Bemis; Neenah, USA | for dummy baseplating |
| Portable Suction | #DF-750 | Doctor's Friend Medical Instrument Co., Inc., Taichung, Taiwan | for surgery |
| Relay GRIN lens | #1050-002177 | Inscopix; Palo Alto, CA, USA | for dummy baseplating/baseplating |
| Stainless steel anchor screws | 1.00 mm diameter, total length 3.00 mm | for surgery | |
| Stereo microscope | #SL720 | Sage Vison; New Taipei City, Taiwan | for surgery/dummy baseplating/baseplating |
| Stereotaxic apparatus | #51673 | Stoelting; IL, USA | for surgery/dummy baseplating/baseplating |
| UV Cure Adhesive | #3321 | Loctite; Düsseldorf, Germany | for testing dental cement |
| V3 UCLA Miniscope | purchased on https://www.labmaker.org/products/miniscope-complete-set-of-components | for surgery/dummy baseplating/baseplating | |
| Xylazine | X1126 | Sigma-Aldrich; St. Louis, MO | for euthanasia |
| Xylocaine pump spray 10% | AstraZeneca; Södertälje, Sweden | for surgery |
References
- Tian, L., Hires, S. A., Looger, L. L. Imaging neuronal activity with genetically encoded calcium indicators. Cold Spring Harbor Protocols. 2012 (6), 647-656 (2012).
- Grienberger, C., Konnerth, A. Imaging calcium in neurons. Neuron. 73 (5), 862-885 (2012).
- Dana, H., et al. High-performance calcium sensors for imaging activity in neuronal populations and microcompartments. Nature Methods. 16 (7), 649-657 (2019).
- Campos, P., Walker, J. J., Mollard, P. Diving into the brain: deep-brain imaging techniques in conscious animals. Journal of Endocrinology. 246 (2), 33-50 (2020).
- Ghosh, K. K., et al. Miniaturized integration of a fluorescence microscope. Nature Methods. 8 (10), 871-878 (2011).
- de Groot, A., et al. NINscope, a versatile miniscope for multi-region circuit investigations. Elife. 9, 49987 (2020).
- Aharoni, D., Hoogland, T. M. Circuit investigations with open-source miniaturized microscopes: past, present and future. Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 141 (2019).
- Resendez, S. L., et al. Visualization of cortical, subcortical and deep brain neural circuit dynamics during naturalistic mammalian behavior with head-mounted microscopes and chronically implanted lenses. Nature Protocols. 11 (3), 566-597 (2016).
- Aharoni, D., Khakh, B. S., Silva, A. J., Golshani, P. All the light that we can see: a new era in miniaturized microscopy. Nature Methods. 16 (1), 11-13 (2019).
- Lee, H. S., Han, J. H. Successful in vivo calcium imaging with a head-mount miniaturized microscope in the amygdala of freely behaving mouse. Journal of Visualized Experiments. (162), e61659 (2020).
- Cai, D. J., et al. A shared neural ensemble links distinct contextual memories encoded close in time. Nature. 534 (7605), 115-118 (2016).
- Chen, K. S., et al. A hypothalamic switch for REM and Non-REM sleep. Neuron. 97 (5), 1168-1176 (2018).
- Shuman, T., et al. Breakdown of spatial coding and interneuron synchronization in epileptic mice. Nature Neuroscience. 23 (2), 229-238 (2020).
- Jimenez, J. C., et al. Anxiety cells in a hippocampal-hypothalamic circuit. Neuron. 97 (3), 670-683 (2018).
- Hart, E. E., Blair, G. J., O’Dell, T. J., Blair, H. T., Izquierdo, A. Chemogenetic modulation and single-photon calcium imaging in anterior cingulate cortex reveal a mechanism for effort-based decisions. Journal of Neuroscience. , 2548 (2020).
- Gulati, S., Cao, V. Y., Otte, S. Multi-layer cortical Ca2+ imaging in freely moving mice with prism probes and miniaturized fluorescence microscopy. Journal of Visualized Experiments. (124), e55579 (2017).
- Zhang, L., et al. Miniscope GRIN lens system for calcium imaging of neuronal activity from deep brain structures in behaving animals. Current Protocols in Neuroscience. 86 (1), 56 (2019).
- Corder, G., et al. An amygdalar neural ensemble that encodes the unpleasantness of pain. Science. 363 (6424), 276-281 (2019).
- Liberti, W. A., Perkins, L. N., Leman, D. P., Gardner, T. J. An open source, wireless capable miniature microscope system. Journal of Neural Engineering. 14 (4), 045001 (2017).
- Lu, J., et al. MIN1PIPE: A miniscope 1-photon-based calcium imaging signal extraction pipeline. Cell Reports. 23 (12), 3673-3684 (2018).
- Giovannucci, A., et al. CaImAn an open source tool for scalable calcium imaging data analysis. Elife. 8, 38173 (2019).
- Lee, A. K., Manns, I. D., Sakmann, B., Brecht, M. Whole-cell recordings in freely moving rats. Neuron. 51 (4), 399-407 (2006).
- Burger, C., et al. Recombinant AAV viral vectors pseudotyped with viral capsids from serotypes 1, 2, and 5 display differential efficiency and cell tropism after delivery to different regions of the central nervous system. Molecular Therapy. 10 (2), 302-317 (2004).
- Royo, N. C., et al. Specific AAV serotypes stably transduce primary hippocampal and cortical cultures with high efficiency and low toxicity. Brain Research. 1190, 15-22 (2008).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), e3564 (2012).
- Ziv, Y., et al. Long-term dynamics of CA1 hippocampal place codes. Nature Neuroscience. 16 (3), 264-266 (2013).
- Gargiulo, S., et al. Mice anesthesia, analgesia, and care, Part I: anesthetic considerations in preclinical research. ILAR journal / National Research Council, Institute of Laboratory Animal Resources. 53 (1), 55-69 (2012).
