本研究报道了一种利用使用过的胚胎培养液对人类胚胎进行染色体筛查的方案，该方法无需胚胎活检，即可通过高通量测序（NGS）实现染色体倍性鉴定。本文详细介绍了实验流程，包括培养液的准备、全基因组扩增（WGA）、高通量测序（NGS）文库构建以及数据分析。
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方法文章
利用培养废液对人类植入前胚胎进行染色体筛查：样本采集与染色体倍性分析
* These authors contributed equally
本文内容
勘误通知
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摘要
摘要
在临床体外受精（IVF）中，目前用于胚胎植入前遗传学检测-非整倍体（PGT-A）的主流方法是从滋养外胚层（TE）中取少量细胞进行活检。TE是形成胎盘的细胞谱系。然而，该方法需要专业技能，具有侵入性，且由于滋养外胚层（TE）与内细胞团（ICM）之间的染色体数目并不总是一致（ICM将发育为胎儿），因此存在假阳性和假阴性的问题。无创性染色体筛查（NICS）技术通过测序培养液中来自TE和ICM释放的DNA，可能为解决上述问题提供一种途径，但此前研究表明其有效性有限。本研究报道了NICS的完整操作流程，包括胚胎培养液取样方法、全基因组扩增（WGA）与文库制备，以及利用分析软件进行高通量测序（NGS）数据分析。考虑到不同胚胎实验室冷冻保存时间存在差异，胚胎学家可依据各自IVF实验室的实际条件，选择两种胚胎培养液采集方法之一。
引言
辅助生殖技术（ART）已越来越多地用于不孕症的治疗。然而，ART（如体外受精，IVF）的成功率仍然有限，且妊娠丢失率显著高于正常人群1。这些问题的主要原因是染色体异常，这在植入前的人类胚胎中较为常见2。植入前染色体非整倍体筛查（PGT-A）是一种在胚胎植入前检测其染色体平衡性的有效方法3,4。一些研究已证实，PGT-A可降低流产率并提高妊娠率5,6,7,8。然而，PGT-A需要复杂的技术专长，必须经过专门培训和实践经验才能掌握。侵入性的胚胎活检操作也可能对胚胎造成潜在损伤9。研究表明，卵裂球活检可能阻碍胚胎后续发育，而滋养层细胞（TE）活检的数量可能影响胚胎的着床率10。尽管胚胎活检对人类的长期生物安全性尚未得到充分评估，但动物研究已显示出其对胚胎发育的负面影响11,1....
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方案
伦理许可已由北京大学第三医院伦理委员会批准。
1. 准备
注意：所需的材料和设备列在材料表中。
- 试剂
- 使用前一晚，在三气培养箱（37 °C、5% CO2 和 5% O2）中，将20–30 µL配子培养基/受精培养基和卵裂期/囊胚期培养基（覆盖矿物油）以及透明质酸酶（置于密封管中）预热并平衡。
- 在通风橱内的工作台面上将透明质酸酶预热至37 °C。
- 根据制造商说明书配制玻璃化冷冻缓冲液和样本采集试剂。
- 工具
- 通过拉制玻璃巴斯德移液管，制备用于样本采集和转移的移液管（内径约200至250 µm）、去颗粒细胞/剥离移液管（内径≥150 µm、约130–140 µm和约120 µm）以及洗涤用移液管（内径约150 µm），并将其尖端火焰抛光。
注意：样本采集/转移、去颗粒细胞及洗涤所用移液管可直接购买。持卵针和注射针也可直接购买。
- 通过拉制玻璃巴斯德移液管，制备用于样本采集和转移的移液管（内径约200至250 µm）、去颗粒细胞/剥离移液管（内径≥150 µm、约130–140 µm和约120 µm）以及洗涤用移液管（内径约150 µm），并将其尖端火焰抛光。
2. 方案1：样本采集
- 卵母细胞-放射冠-卵丘复合体（OCCCs）在使用透明质酸酶消化前的预处理
-
....
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结果
本研究将所提出的方法应用于一名患者。在应用NICS分析之前，已获得伦理审查委员会（IRB）批准及知情同意。本研究共获得6枚囊胚，并在第4至第5天的培养基中对全部6枚胚胎进行了NICS检测。NICS检测发现其中5枚胚胎的染色体异常源于父母的平衡易位，因此无法用于移植（图4A-E）。两枚胚胎的NICS结果显示出相同的核型45，XN和-18（×1），均为18号染色体缺失（图4A，B）。核型46，XN，-1p（pter→p21.1，×1）仅表现为1号染色体短臂pter→p21.1区域的缺失（图4D）。
NICS 结果显示核型为 46, XN, +1p (pter→p21.2, ×3) 和 -18(q21.32→qter, ×1)，表明 18 号染色体长臂 q21.32→qter 区域缺失，同时 1 号染色体短臂 pter→p21.2 区域存在重复.......
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讨论
修改与故障排除
如果NICS结果受到亲本遗传物质的污染，需确保完全去除所有卵丘-放射冠细胞，并确保通过ICSI进行受精。应避免培养基储存或模板制备过程不当，这些因素可能导致DNA降解。实验操作空间应使用DNase和RNase去污试剂彻底净化。为防止来自其他胚胎的交叉污染，自第4天起，每个胚胎始终单独培养于一滴培养液中。将胚胎移入最终培养液滴的时间适当延迟，可进一步降低污染现象30,31,32,33。为最大限度减少母源性污染，Kuznyetsov34对第0天至第4天的胚胎培养流程进行了改进，包括通过移液和冲洗仔细清除残留的放射冠细胞。
Lane 等人30
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披露
Yaxin Yao、Jieliang Ma、Jing Wang 和 Sijia Lu 是翌珂omics有限公司的员工。
致谢
作者感谢薄士平和马淑洁在下一代测序数据分析方面的帮助。资助：本研究得到国家重点研发计划（项目编号：2018YFC1003100）的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 1.5 mL EP管，0.2 mL PCR管 | Axygen | MCT-150-C, PCR-02-C | 推荐使用无DNase/RNase、低吸附的PCR管和1.5 mL微量离心管。 |
| 10 µL、200 µL、1000 µL 无DNase/RNase吸头 | Axygen | T-300-R-S, T-200-Y-R-S, T-1000-B-R-S | 可替换为其他品牌/用于样本转移 |
| 100% 乙醇 | 国药化学 | 10009218 | 可替换为其他品牌/用于DNA文库纯化 |
| 条形码引物1-48 | 亿科基因组学 | NICSInst文库制备试剂盒中的试剂 | 用于文库扩增 |
| BD Falcon 器官培养皿，无菌 | BD Bioscience | 363037 | 可替换为其他品牌/用于胚胎培养 |
| BD Falcon 组织培养皿（易握型），无菌 | BD Bioscience | 353001 | 可替换为其他品牌/用于胚胎培养 |
| BD Falcon 组织培养皿，无菌 | BD Bioscience | 353002 | 可替换为其他品牌/用于胚胎培养 |
| 细胞裂解缓冲液 | 亿科基因组学 | NICSInst文库制备试剂盒中的试剂 | 用于培养基预处理 |
| 细胞裂解酶 | 亿科基因组学 | NICSInst文库制备试剂盒中的试剂 | 用于培养基预处理 |
| ChromGo软件 | 亿科基因组学 | 数据分析 | |
| CMPure磁珠 | 亿科基因组学 | NICSInst文库制备试剂盒中的试剂 | 用于文库纯化 |
| Cryotop开放式系统 | KITAZATO BioPharma | 81110 | 可替换为其他品牌/用于胚胎玻璃化冷冻 |
| 蒸馏水 | 亿科基因组学 | NICSInst文库制备试剂盒中的试剂 | 用于溶解DNA |
| ES（玻璃化冷冻试剂盒） | KITAZATO BioPharma | 玻璃化冷冻试剂盒中的试剂 | 可替换为其他品牌/用于胚胎玻璃化冷冻 |
| HOLDNIG | ORIGIO | MPH-MED-35 | 可替换为其他 品牌/用于ICSI |
| 透明质酸酶溶液，80 U/mL | SAGE | ART4007-A | 可替换为其他品牌/消化卵母细胞-放射冠-颗粒细胞复合体 |
| ICSI | ORIGIO | MPH-35-35 | 可替换为其他品牌/用于ICSI |
| Illumina MiSeq® 系统 | Illumina | SY-410-1001 | 用于文库测序 |
| 培养箱 | Labotect | Inkubator C16 | 可替换为其他品牌/用于胚胎培养 |
| 文库缓冲液 | 亿科基因组学 | NICSInst文库制备试剂盒中的试剂 | 用于文库扩增 |
| 文库酶混合液 | 亿科基因组学 | NICSInst文库制备试剂盒中的试剂 | 用于文库扩增 |
| 磁力架 | DynaMagTM-2 | 12321D | 用于文库纯化 |
| 显微镜 | OLYMPUS | 1X71 | 可替换为其他品牌/用于胚胎观察 |
| 小型离心机 | ESSENSCIEN | ELF6 | 用于分离 |
| MT酶混合液 | 亿科基因组学 | NICSInst文库制备试剂盒中的试剂 | 用于培养基预处理 |
| NICSInst文库制备试剂盒 | 亿科基因组学 | KT1000800324 | 全基因组扩增与文库构建 |
| NICSInst样本制备工作站 | 亿科基因组学 | ME1001003 | 扩增DNA |
| Nunc IVF 4孔培养皿 | Thermo Scientific | 144444 | 可替换为其他品牌/用于胚胎洗涤和囊胚培养 |
| 巴斯德吸管 | Oirgio | MXL3-IND-135 | 可替换为其他品牌/用于胚胎转移 |
| 巴斯德吸管 | ORIGIO | PP-9-1000 | 可替换为其他品牌/用于体外受精实验室 |
| 预文库缓冲液 | 亿科基因组学 | NICSInst文库制备试剂盒中的试剂 | 文库前制备 |
| 预文库酶 | 亿科基因组学 | NICSInst文库制备试剂盒中的试剂 | 文库前制备 |
| Qubit® 3.0 荧光计 | Thermo Scientific | Q33216 | 用于文库定量 |
| Quinn's Advantage 囊胚培养基 | SAGE | ART-1029 | 用于胚胎囊胚阶段培养 |
| Quinn's Advantage 卵裂期培养基 | SAGE | ART-1026 | 可替换为其他品牌/用于胚胎卵裂阶段培养 |
| Quinn's Advantage 受精培养基 | SAGE | ART-1020 | 可替换为其他品牌/用于卵母细胞与精子受精 |
| Quinn's Advantage 含HEPES的m-HTF培养基 | SAGE | ART-1023 | 可替换为其他品牌/用于胚胎培养 |
| Quinn's Advantage SPS血清蛋白替代试剂盒 | SAGE | ART-3010 | 可替换为其他品牌/用于去除卵母细胞周围的颗粒细胞 |
| Quinn's Advantage 组织培养矿物油 | SAGE | ART-4008P | 可替换为其他品牌/用于覆盖培养基 |
| STRIPPER 吸头 | ORIGIO | MXL3-IND-135 | 可替换为其他品牌/用于去除颗粒细胞 |
| 玻璃化冷冻Cryotop开放式系统 | KIZTAZATO | 81111 | 可替换为其他品牌/用于胚胎玻璃化冷冻 |
| 玻璃化冷冻试剂盒 | KITAZATO BioPharma | VT101 | 可替换为其他品牌/用于胚胎玻璃化冷冻 |
| Vortex振荡器 | 麒麟贝儿 | DNYS8 | 样本混匀 |
| VS（玻璃化冷冻试剂盒） | KITAZATO BioPharma | 玻璃化冷冻试剂盒中的试剂 | 可替换为其他品牌/用于胚胎玻璃化冷冻 |
| ZILOS-tk 激光系统 | Hamilton Thorne | CLASS 1 激光 | 可替换为其他品牌/用于人工囊胚腔塌陷 |
参考文献
- Barlow, P. Early pregnancy loss and obstetrical risk after in-vitro fertilization and embryo replacement. Human Reproduction. 3 (5), 671-675 (1988).
- Munne, S. Chromosome abnormalities and their relationshi....
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重印与许可
勘误
Formal Correction: Erratum: Chromosome Screening of Human Preimplantation Embryos by Using Spent Culture Medium: Sample Collection and Chromosomal Ploidy Analysis
Posted by JoVE Editors on 10/01/2021. Citeable Link.
An erratum was issued for: Chromosome Screening of Human Preimplantation Embryos by Using Spent Culture Medium: Sample Collection and Chromosomal Ploidy Analysis. The Protocol and Representaive Results sections were updated.
In the Protocol, step 3.8.2 was updated from:
After logging into the system, click Create Submission under the NICS tab. Then, select the sequencing platform, choose ChromInst for the reagent, enter the project information in the box under Project ID, set the analysis preferences and upload the files. Once all sequencing files are successfully uploaded, click Submit to start the analysis (Figure 3A).
to:
After logging into the system, click Create Submission under the NICS-A tab. Then, choose NGS for the platform, select corporation, choose ChromInst for the reagent, enter the project information in the box under Project ID, set the analysis preferences and upload the files. Once all sequencing files are successfully uploaded, click Submit to start the analysis (Figure 3A).
In the Representative Results, Figure 3 was updated from:
Figure 3. Data Analysis. (A) The page of Create Submission. There are different options for the user application. For sequencing platform, users can choose Illumina or Ion Torrent. For analysis criterion, there are two length detection resolution for selection, the whole chromosome and whole arm level. The users also can choose whether the mosaicism or gender information is reported. Finished the above parameter setting,click on the box under File upload and choose the appropriate sequencing files to upload. For Illumina, choose the files with an extension of fastq.gz. For Ion Torrent platform, choose files with an extension of bam. Click Submit to start the analysis after successfully upload. (B) The view of summary table. The summary table consists of following information: Sample Name: The name of each NICS sample is listed; Data QC: Indicates whether the sequencing file passes the QC for NICS analysis; Conclusion: Indicates whether the NICS analysis is normal or abnormal, "N/A" indicates no conclusive result is available; Gender: If the user chooses to report the sex information, this column will appear in the summary table; Karyotype: Shows the analysis results; CNV plot (Whole Genome): View the CNV profiles of all chromosomes; CNV plot (By Chromosome): View the CNV profiles of each chromosome. (C) The Save Report Page. Click Export report button next to the Summary of Results. Select the information you want to show on the final report and click Export. Select Save File in the appearing dialog window and then click OK. The reports will be saved to the Download folder of the computer. Please click here to view a larger version of this figure.
to:
Figure 3. Data Analysis. (A) There are different options for the user application. For sequencing platform corporation, users can choose Illumina, Ion Torrent or MGI. The users can choose whether the gender information is reported. Finished the above parameter setting, click on the box under File upload and choose the appropriate sequencing files to upload. For Illumina, choose the files with an extension of fastq.gz. Click Submit to start the analysis after successfully upload. (B) The view of summary table. The summary table consists of following information: Sample Name: The name of each NICS sample is listed; Data QC: Indicates whether the sequencing file passes the QC for NICS analysis; AI Rating: The rating (A, B or C) for each NICS sample; AI_Rating Interpretation: Evaluation of embryo implantation potential; AI Grading: The score for each NICS sample; CNV plot (Whole Genome): View the CNV profiles of all chromosomes; (C) The Save Report Page. Click Export report button next to the Summary of Results. Select the information you want to show on the final report and click Export. The reports will be saved to the Download folder of your computer. Please click here to view a larger version of this figure.
