Summary

Extractie en visualisatie van eiwitaggregaten na behandeling van Escherichia coli met een proteotoxische stressor

Published: June 29, 2021
doi:

Summary

Dit protocol beschrijft de extractie en visualisatie van geaggregeerde en oplosbare eiwitten uit Escherichia coli na behandeling met een proteotoxisch antimicrobieel middel. Het volgen van deze procedure maakt een kwalitatieve vergelijking mogelijk van de vorming van eiwitaggregaten in vivo in verschillende bacteriestammen en/of tussen behandelingen.

Abstract

De blootstelling van levende organismen aan omgevings- en cellulaire stress veroorzaakt vaak verstoringen in eiwithomeostase en kan resulteren in eiwitaggregatie. De accumulatie van eiwitaggregaten in bacteriële cellen kan leiden tot significante veranderingen in het cellulaire fenotypische gedrag, waaronder een vermindering van groeisnelheden, stressbestendigheid en virulentie. Er bestaan verschillende experimentele procedures voor het onderzoek van deze stressor-gemedieerde fenotypen. Dit artikel beschrijft een geoptimaliseerde test voor de extractie en visualisatie van geaggregeerde en oplosbare eiwitten uit verschillende Escherichia coli-stammen na behandeling met een zilver-ruthenium-bevattende antimicrobiële stof. Van deze verbinding is bekend dat het reactieve zuurstofsoorten genereert en wijdverspreide eiwitaggregatie veroorzaakt.

De methode combineert een op centrifugatie gebaseerde scheiding van eiwitaggregaten en oplosbare eiwitten uit behandelde en onbehandelde cellen met daaropvolgende scheiding en visualisatie door natriumdodecylsulfaat-polyacrylamidegelelektroforese (SDS-PAGE) en Coomassie-kleuring. Deze aanpak is eenvoudig, snel en maakt een kwalitatieve vergelijking mogelijk van de vorming van eiwitaggregaten in verschillende E. coli-stammen. De methodologie heeft een breed scala aan toepassingen, waaronder de mogelijkheid om de impact van andere proteotoxische antimicrobiële stoffen op in vivo eiwitaggregatie in een breed scala aan bacteriën te onderzoeken. Bovendien kan het protocol worden gebruikt om genen te identificeren die bijdragen aan een verhoogde resistentie tegen proteotoxische stoffen. Gelbanden kunnen worden gebruikt voor de daaropvolgende identificatie van eiwitten die bijzonder gevoelig zijn voor aggregatie.

Introduction

Bacteriën worden onvermijdelijk blootgesteld aan een groot aantal omgevingsstressen, waaronder een lage pH (bijvoorbeeld in de maag van zoogdieren)1,2,reactieve zuurstof- en chloorsoorten (ROS / RCS) (bijvoorbeeld tijdens oxidatieve uitbarsting in fagocyten)3,4,5,verhoogde temperaturen (bijvoorbeeld in warmwaterbronnen of tijdens hitteschok)6,7en verschillende krachtige antimicrobiële stoffen (bijv. AGXX gebruikt in dit protocol)8. Eiwitten zijn bijzonder kwetsbaar voor een van deze stressoren en blootstelling kan leiden tot het ontvouwen van eiwitten die vervolgens zadenaggregatie veroorzaken. Alle organismen maken gebruik van beschermende systemen die hen in staat stellen om te gaan met eiwit misfolding9. Ernstige stress kan echter de eiwitkwaliteitscontrolemachines overweldigen en de secundaire en / of tertiaire structuur van eiwitten verstoren, wat uiteindelijk eiwitten inactiveert. Als gevolg hiervan kunnen eiwitaggregaten ernstige afbreuk doen aan kritieke cellulaire functies die nodig zijn voor bacteriële groei en overleving, stressbestendigheid en virulentie10. Daarom is onderzoek gericht op eiwitaggregatie en de gevolgen ervan in bacteriën een relevant onderwerp vanwege de potentiële impact op de bestrijding van infectieziekten.

Warmte-geïnduceerde eiwit ontvouwen en aggregatie zijn vaak omkeerbaar7. Daarentegen kunnen andere proteotoxische spanningen, zoals oxidatieve stress, onomkeerbare eiwitmodificaties veroorzaken door de oxidatie van specifieke aminozuurzijketens, wat resulteert in eiwitont-/misvouwen en uiteindelijk eiwitaggregatie4. Stress-geïnduceerde vorming van onoplosbare eiwitaggregaten is uitgebreid bestudeerd in de context van moleculaire chaperonnes en hun beschermende functies in gist en bacteriën11,12,13. Er zijn verschillende protocollen gepubliceerd die een verscheidenheid aan biochemische technieken gebruiken voor de isolatie en analyse van onoplosbare eiwitaggregaten14,15,16,17. De bestaande protocollen zijn voornamelijk gebruikt om bacteriële eiwitaggregatie te bestuderen bij hitteschok en /of identificatie van moleculaire chaperones. Hoewel deze protocollen zeker een vooruitgang in het veld zijn geweest, zijn er enkele grote ongemakken in de experimentele procedures omdat ze (i) een groot bacteriekweekvolume van maximaal 10 L14,17, (ii) gecompliceerde fysieke verstoringsprocessen vereisen, waaronder het gebruik van celverstoorders, Franse pers en / of ultrasoonapparaat14,15,17of (iii) tijdrovende herhaalde herhaalde wassen en incubatie stappen15,16,17.

Dit artikel beschrijft een aangepast protocol dat gericht is op het aanpakken van de beperkingen van de vorige benaderingen en maakt de analyse mogelijk van de hoeveelheid eiwitaggregaten gevormd in twee verschillende Escherichia coli-stammen na behandeling met een proteotoxische antimicrobiële oppervlaktecoating. De coating bestaat uit metaal-zilver (Ag) en ruthenium (Ru) -geconditioneerd met ascorbinezuur, en de antimicrobiële activiteit wordt bereikt door het genereren van reactieve zuurstofsoorten8,18. Hierin is een gedetailleerde beschrijving van de bereiding van de bacteriecultuur na behandeling met de antimicrobiële verbinding en een vergelijking van de eiwitaggregatiestatus bij blootstelling van twee E. coli-stammen met verschillende gevoeligheidsprofielen aan toenemende concentratie van de antimicrobiële stof. De beschreven methode is goedkoop, snel en reproduceerbaar en kan worden gebruikt om eiwitaggregatie te bestuderen in aanwezigheid van andere proteotoxische verbindingen. Bovendien kan het protocol worden aangepast om de impact te analyseren die specifieke gendeleties hebben op eiwitaggregatie in een verscheidenheid aan verschillende bacteriën.

Protocol

1. Stressbehandeling van E. coli stammen MG1655 en CFT073 Ent 5 ml lysogeniebouillon (LB) medium met een enkele kolonie commensale E. coli stam MG1655 en uropathogene E. coli (UPEC) stam CFT073, respectievelijk, en incubeer gedurende 14-16 uur (‘s nachts) bij 37 °C en 300 tpm.OPMERKING: Escherichia coli CFT073 is een menselijke ziekteverwekker. De behandeling van CFT073 moet worden uitgevoerd met passende bioveiligheidsmaatregelen in een bioveiligheidsniveau 2-gecertific…

Representative Results

Figuur 6: Representatieve resultaten van antimicrobieel geïnduceerde eiwitaggregatie in commensale Escherichia coli stam MG1655 en UPEC stam CFT073. E. coli stammen MG1655 en CFT073 werden gekweekt bij 37 °C en 300 rpm tot OD600= 0,5-0,55 in MOPS-g media voordat ze werden behandeld met de aangegeven concentraties (-, 0 mg/ml; +,…

Discussion

Dit protocol beschrijft een geoptimaliseerde methodologie voor de analyse van eiwitaggregatievorming na behandeling van verschillende E. coli-stammen met een proteotoxisch antimicrobieel middel. Het protocol maakt de gelijktijdige extractie van onoplosbare en oplosbare eiwitfracties uit behandelde en onbehandelde E. coli-cellen mogelijk. In vergelijking met bestaande protocollen voor eiwitaggregatie-isolatie uit cellen14,15,<sup class…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dit werk werd ondersteund door illinois state university school of biological sciences startup fondsen, Illinois State University New Faculty Initiative Grant, en de NIAID grant R15AI164585 (aan J.-U. D.). G.M.A. werd ondersteund door het Illinois State University Undergraduate Research Support Program (aan G.M.A.). K.P.H. werd ondersteund door een RISE-beurs van de Duitse Academische Uitwisselingsdienst (DAAD). De auteurs bedanken Dr. Uwe Landau en Dr. Carsten Meyer van Largentech Vertriebs GmbH voor het leveren van het AGXX poeder. Figuur 1, Figuur 2, Figuur 3, Figuur 4en Figuur 5 zijn gegenereerd met Biorender.

Materials

Chemicals/Reagents
Acetone Fisher Scientific 67-64-1
30% Acrylamide/Bisacrylamide solution 29:1 Bio-Rad 1610156
Ammonium persulfate Millipore Sigma A3678-100G
Benzonase nuclease Sigma E1014-5KU
Bluestain 2 Protein ladder, 5-245 kDa GoldBio P008-500
β-mercaptoethanol Millipore Sigma M6250-100ML
Bromophenol blue GoldBio B-092-25
Coomassie Brilliant Blue R-250 MP Biomedicals LLC 821616
D-Glucose Millipore Sigma G8270-1KG
D-Sucrose Acros Organics 57-50-1
Ethylenediamine tetra acetic acid (EDTA) Sigma-Aldrich SLBT9686
Glacial Acetic acid Millipore Sigma ARK2183-1L
Glycerol, 99% Sigma-Aldrich G5516-1L
Glycine GoldBio G-630-1
Hydrochloric acid, ACS reagent Sigma-Aldrich 320331-2.5L
Isopropanol (2-Propanol) Sigma 402893-2.5L
LB broth (Miller) Millipore Sigma L3522-1KG
LB broth with agar (Miller) Millipore Sigma L2897-1KG
Lysozyme GoldBio L-040-25
10x MOPS Buffer Teknova M2101
Nonidet P-40 Thomas Scientific 9036-19-5
Potassium phosphate, dibasic Sigma-Aldrich P3786-1KG
Potassium phosphate, monobasic Acros Organics 7778-77-0
Sodium dodecyl sulfate (SDS) Sigma-Aldrich L3771-500G
Tetramethylethylenediamine (TEMED) Millipore Sigma T9281-50ML
Thiamine Sigma-Aldrich T4625-100G
100% Trichloroacetic acid Millipore Sigma T6399-100G
Tris base GoldBio T-400-1
Material/Equipment
Centrifuge tubes (15 mL) Alkali Scientific JABG-1019
Erlenmeyer flask (125 mL) Carolina 726686
Erlenmeyer flask (500 mL) Carolina 726694
Freezer: -80 °C Fisher Scientific
Glass beads (0.5 mm) BioSpec Products 1107-9105
Microcentrifuge Hermle Z216MK
Microcentriguge tubes (1.7 mL) VWR International 87003-294
Microcentriguge tubes (2.0 mL) Axygen Maxiclear Microtubes MCT-200-C
Plastic cuvettes Fischer Scientific 14-377-012
Power supply ThermoFisher Scientific EC105
Rocker Alkali Scientific RS7235
Shaking incubator (37 °C) Benchmark Scientific
Small glass plate Bio-Rad 1653311
Spacer plates (1 mm) Bio-Rad 1653308
Spectrophotometer Thermoscientific 3339053
Tabletop centrifuge for 15 mL centrifuge tubes Beckman-Coulter
Vertical gel electrophoresis chamber Bio-Rad 1658004
Vortexer Fisher Vortex Genie 2 12-812
Thermomixer Benchmark Scientific H5000-HC
10 well comb Bio-Rad 1653359

References

  1. Dahl, J. -. U., et al. HdeB functions as an acid-protective chaperone in bacteria. Journal of Biological Chemistry. 290 (1), 65-75 (2015).
  2. Foit, L., George, J. S., Zhang, B. W., Brooks, C. L., Bardwell, J. C. A. Chaperone activation by unfolding. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (14), 1254-1262 (2013).
  3. Sultana, S., Foti, A., Dahl, J. -. U. Bacterial defense systems against the neutrophilic oxidant hypochlorous acid. Infection and Immunity. 88 (7), 00964 (2020).
  4. Dahl, J. -. U., Gray, M. J., Jakob, U. Protein quality control under oxidative stress conditions. Journal of Molecular Biology. 427 (7), 1549-1563 (2015).
  5. Groitl, B., Dahl, J. -. U., Schroeder, J. W., Jakob, U. Pseudomonas aeruginosa defense systems against microbicidal oxidants. Molecular Microbiology. 106 (3), 335-350 (2017).
  6. Casadevall, A. Thermal restriction as an antimicrobial function of fever. PLoS Pathogens. 12 (5), 1005577 (2016).
  7. Richter, K., Haslbeck, M., Buchner, J. The heat shock response: life on the verge of death. Molecular Cell. 40 (2), 253-266 (2010).
  8. Van Loi, V., Busche, T., Preuß, T., Kalinowski, J., Bernhardt, J. The AGXX ® antimicrobial coating causes a thiol-specific oxidative stress response and protein S-bacillithiolation in Staphylococcus aureus. Frontiers in Microbiology. 9, 3037 (2018).
  9. Anfinsen, C. B., Scheraga, H. A. Experimental and theoretical aspects of protein folding. Advances in Protein Chemistry. 29, 205-300 (1975).
  10. Schramm, F. D., Schroeder, K., Jonas, K. Protein aggregation in bacteria. FEMS Microbiology Reviews. 44 (1), 54-72 (2020).
  11. Tomoyasu, T., Mogk, A., Langen, H., Goloubinoff, P., Bukau, B. Genetic dissection of the roles of chaperones and proteases in protein folding and degradation in the Escherichia coli cytosol. Molecular Microbiology. 40 (2), 397-413 (2001).
  12. Gray, M. J., et al. Polyphosphate is a primordial chaperone. Molecular Cell. 53 (5), 689-699 (2014).
  13. Weids, A. J., Ibstedt, S., Tamás, M. J., Grant, C. M. Distinct stress conditions result in aggregation of proteins with similar properties. Scientific Reports. 6, 24554 (2016).
  14. Mogk, A., et al. Identification of thermolabile Escherichia coli proteins: prevention and reversion of aggregation by DnaK and ClpB. EMBO Journal. 18 (24), 6934-6949 (1999).
  15. Fay, A., Glickman, M. S. An essential nonredundant role for mycobacterial DnaK in native protein folding. PLoS Genetics. 10 (7), 1004516 (2014).
  16. Schramm, F. D., Heinrich, K., Thüring, M., Bernhardt, J., Jonas, K. An essential regulatory function of the DnaK chaperone dictates the decision between proliferation and maintenance in Caulobacter crescentus. PLoS Genetics. 13 (12), 1007148 (2017).
  17. Maisonneuve, E., Fraysse, L., Moinier, D., Dukan, S. Existence of abnormal protein aggregates in healthy Escherichia coli cells. Journal of Bacteriology. 190 (3), 887-893 (2008).
  18. Heiss, A., Freisinger, B., Held-Föhn, E. Enhanced antibacterial activity of silver-ruthenium coated hollow microparticles. Biointerphases. 12 (5), (2017).
  19. Papnayotou, I., Sun, B., Roth, A. F., Davis, N. G. Protein aggregation induced during glass bead lysis of yeast. Yeast. 27 (10), 801-816 (2010).
  20. Chuang, S. E., Blattner, F. R. Characterization of twenty-six new heat shock genes of Escherichia coli. Journal of Bacteriology. 175 (16), 5242-5252 (1993).
  21. Imlay, J. A. The molecular mechanisms and physiological consequences of oxidative stress: Lessons from a model bacterium. Nature Reviews Microbiology. 11 (7), 443-454 (2013).
  22. Mühlhofer, M., et al. The heat shock response in yeast maintains protein homeostasis by chaperoning and replenishing proteins. Cell Reports. 29 (13), 4593-4607 (2019).
  23. Chandrangsu, P., Rensing, C., Helmann, J. D. Metal homeostasis and resistance in bacteria. Nature Reviews Microbiology. 15, 338-350 (2017).
  24. Stevens, M., et al. HSP60/10 chaperonin systems are inhibited by a variety of approved drugs, natural products, and known bioactive molecules. Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters. 29 (9), 1106-1112 (2019).
  25. Schramm, F. D., Schroeder, K., Alvelid, J., Testa, I., Jonas, K. Growth-driven displacement of protein aggregates along the cell length ensures partitioning to both daughter cells in Caulobacter crescentus. Molecular Microbiology. 111 (6), 1430-1448 (2019).

Play Video

Cite This Article
Sultana, S., Anderson, G. M., Hoffmann, K. P., Dahl, J. Extraction and Visualization of Protein Aggregates after Treatment of Escherichia coli with a Proteotoxic Stressor. J. Vis. Exp. (172), e62628, doi:10.3791/62628 (2021).

View Video