التنميط المكاني للبروتين وتعبير الحمض النووي الريبي في الأنسجة: نهج لضبط التشريح المجهري الافتراضي
Summary
هنا ، نصف بروتوكولا لضبط مناطق الاهتمام (ROIs) لتقنيات Spatial Omics لتوصيف البيئة المكروية للورم بشكل أفضل وتحديد مجموعات خلايا معينة. بالنسبة لفحوصات البروتينات ، يمكن للبروتوكولات المخصصة الآلية توجيه اختيار عائد الاستثمار ، بينما يمكن ضبط فحوصات النسخ باستخدام عائد استثمار صغير يصل إلى 50 ميكرومتر.
Abstract
يتيح تعدد الإرسال تقييم العديد من العلامات على نفس النسيج مع توفير السياق المكاني. تسمح تقنيات Omics المكانية بتعدد إرسال كل من البروتين والحمض النووي الريبي من خلال الاستفادة من الأجسام المضادة والمجسات الموسومة بالصور ، على التوالي. يتم شق Oligos وقياسها كميا من مناطق محددة عبر الأنسجة لتوضيح البيولوجيا الأساسية. هنا ، توضح الدراسة أنه يمكن استخدام بروتوكولات تصور الأجسام المضادة المخصصة الآلية لتوجيه اختيار عائد الاستثمار بالتزامن مع فحوصات البروتينات المكانية. لم تظهر هذه الطريقة المحددة أداء مقبولا مع فحوصات النسخ المكاني. يصف البروتوكول تطوير مقايسة 3-plex immunofluorescent (IF) لتصور العلامة على منصة آلية ، باستخدام تضخيم إشارة التيراميد (TSA) لتضخيم إشارة الفلورسنت من هدف بروتين معين وزيادة تجمع الأجسام المضادة للاختيار من بينها. تم أتمتة بروتوكول التصور باستخدام اختبار 3-plex تم التحقق من صحته بدقة لضمان الجودة وقابلية الاستنساخ. بالإضافة إلى ذلك ، تم تقييم تبادل DAPI لأصباغ SYTO للسماح بتصوير مقايسات IF القائمة على TSA على منصة التنميط المكاني. بالإضافة إلى ذلك ، اختبرنا القدرة على اختيار عائد استثمار صغير باستخدام مقايسة النسخ المكاني للسماح بالتحقيق في مجالات اهتمام محددة للغاية (على سبيل المثال ، المناطق المخصبة لنوع خلية معين). تم جمع عائد الاستثمار بقطر 50 ميكرومتر و 300 ميكرومتر ، وهو ما يتوافق مع حوالي 15 خلية و 100 خلية على التوالي. تم عمل العينات في المكتبات وتسلسلها للتحقيق في القدرة على اكتشاف الإشارات من عائد الاستثمار الصغير والمناطق الخاصة بالملف الشخصي في الأنسجة. لقد قررنا أن تقنيات البروتينات المكانية تستفيد بشكل كبير من البروتوكولات الآلية الموحدة لتوجيه اختيار عائد الاستثمار. على الرغم من أن بروتوكول التصور الآلي هذا لم يكن متوافقا مع فحوصات النسخ المكاني ، فقد تمكنا من اختبار وتأكيد أنه يمكن اكتشاف مجموعات خلايا معينة بنجاح حتى في عائد الاستثمار الصغير باستخدام بروتوكول التصور اليدوي القياسي.
Introduction
يستمر التقدم في تقنيات تعدد الإرسال في توفير أدوات توصيف أفضل للأهداف الموجودة في الأورام. البيئة المكروية للورم (TME) هي نظام معقد من الخلايا السرطانية ، والخلايا المناعية المتسللة ، والسدى ، حيث تكون المعلومات المكانية ضرورية لفهم وتفسير آليات التفاعل بين المؤشرات الحيوية ذات الأهميةبشكل أفضل 1. مع التقنيات الناشئة مثل GeoMx Digital Spatial Profiler (DSP) و 10x Visium ، يمكن اكتشاف أهداف متعددة وقياسها كميا في وقت واحد ضمن سياقها المكاني. يمكن أن يؤدي استخدام بروتوكولات التألق المناعي التي تسهل تصور الأنسجة إلى زيادة تحسين قدرات التنميط المكاني لهذه التقنيات.
تتكون تقنية Spatial Omics التي ركزنا عليها لتطوير هذه الطريقة من البروتينات المكانية ومقايسات النسخ حيث يتم ربط oligonucleotides بالأجسام المضادة أو مجسات الحمض النووي الريبي عبر رابط ضوئي حساس للأشعة فوق البنفسجية. يتم تمييز الشرائح النسيجية بهذه الأجسام المضادة أو المجسات المترافقة ثم يتم تصويرها على منصة التنميط المكاني. بعد ذلك ، يتم اختيار عائد الاستثمار بأحجام وأشكال مختلفة للإضاءة ، ويتم استنشاق قليل النوكليوتيدات المشقوقة ضوئيا وتجميعها في لوحة ذات 96 بئرا. يتم تحضير قليل النيوكليوتيدات المشقوقة ضوئيا ليتم قياسها كميا إما باستخدام نظام Nanostring nCounter أو تسلسل الجيل التالي (NGS) 2,3 (الشكل 1) 4,5.
تختلف توزيعات الخلايا داخل الأنسجة ، والقدرة على توصيف مواقع محددة للخلايا باستخدام علامات محددة وأحجام عائد استثمار مختلفة لها أهمية كبيرة لفهم بيئة الأنسجة بشكل كامل وتحديد ميزات محددة. في تقنية Spatial Omics المذكورة هنا ، يستخدم بروتوكول التصور القياسي أجساما مضادة مترافقة مباشرة وهو بروتوكول يدوي. العلامات القياسية للتمييز بين الورم والسدى هي panCytokeratin (panCK) و CD45 6,7 ، ولكن هناك حاجة إلى علامات إضافية لاستهداف مجموعات خلايا معينة ذات أهمية. علاوة على ذلك ، فإن استخدام الأجسام المضادة الفلورية المترافقة مباشرة يفتقر إلى التضخيم ، مما يحد من اختيار الأجسام المضادة إلى علامات وفيرة. بالإضافة إلى ذلك ، تخضع المقايسات اليدوية لتنوع أكبر من سير العمل الآلي8. لذلك ، من المستحسن أن يكون لديك بروتوكول تصور قابل للتخصيص وتلقائي ومضخم لاختيار عائد الاستثمار.
هنا ، توضح الدراسة أنه بالنسبة لمقايسات البروتينات المكانية ، يمكن استخدام تقنية TSA لبروتوكولات التصور على منصة آلية مما يؤدي إلى فحص أكثر استهدافا وتوحيدا. بالإضافة إلى ذلك ، تتيح المقايسات القائمة على TSA استخدام علامات منخفضة التعبير ، مما يزيد من نطاق الأهداف التي يمكن اختيارها للتصور. تم تطوير اختبار 3-plex ل panCK و FAP و Antibody X باستخدام منصة آلية حيث تم استخدام panCK و FAP للتمييز بين الورم والسدى ، على التوالي. الجسم المضاد X هو بروتين انسجة كثيرا ما يصادف في الأورام ، لكن بيولوجيته وتأثيره على المناعة المضادة للورم غير مفهومين تماما. يمكن أن يوضح توصيف النسيج المناعي في المناطق الغنية بالجسم المضاد X دوره في المناعة المضادة للورم والاستجابة العلاجية ، فضلا عن إمكاناته كهدف دوائي.
في حين أثبتت لوحات التصور TSA الآلية المخصصة نجاحها في فحوصات البروتينات المكانية ، لا يمكن تأكيد تطبيق هذه المقايسات لمقايسات النسخ المكاني. ويرجع ذلك على الأرجح إلى الكواشف والبروتوكول المستخدم لبروتوكولات التصور الآلي ، والتي يبدو أنها تعرض سلامة الحمض النووي الريبي للخطر. إن إدراك أنه يمكن استخدام بروتوكول وضع العلامات الآلي لعلامات التصور لمقايسات البروتينات المكانية ولكن ليس لفحوصات النسخ المكاني يوفر إرشادات مهمة حول تصميمات مقايسة تقنية Spatial Omics.
بالإضافة إلى ذلك ، توضح الدراسة أنه يمكن استخدام اختبار النسخ المكاني لتحديد الأهداف في مناطق صغيرة يصل قطرها إلى 50 ميكرومتر ، أو ما يقرب من 15 خلية. تم اختيار اثنين من عائد الاستثمار مختلفي الحجم لاختبار قدرة الفحص على اكتشاف النصوص أيضا في عائد الاستثمار الصغير. لكل منطقة ذات أهمية ، تم جمع oligos المقابلة لأهداف 1,800 mRNA وتحويلها إلى مكتبات وفقا لبروتوكول منصة التنميط المكاني. تمت فهرسة المكتبات بشكل فردي ، ثم تجميعها وتسلسلها. سمح ذلك بتقييم كل من كفاءة التجميع والقدرة على تحديد مجموعات خلايا معينة في عائد استثمار صغير.
توضح هذه الورقة أنه بالنسبة لفحوصات البروتينات المكانية ، يمكن استخدام بروتوكول آلي لتوجيه اختيار عائد الاستثمار على علامات محددة ذات أهمية لاستهداف استجواب مناطق الأنسجة ذات الصلة بشكل انتقائي وتوصيف البيئة المكانية للأنسجة. علاوة على ذلك ، أثبتنا أنه يمكن استخدام عائد استثمار أصغر لفحوصات النسخ المكاني لاكتشاف وتوصيف مجموعات خلايا معينة.
Protocol
Representative Results
Discussion
حتى الآن ، يتم استخدام الأجسام المضادة الفلورية المترافقة مباشرة في بروتوكول يدوي بشكل شائع كلوحات تصور للبروتينات المكانية أو فحوصات النسخ المكاني 9,10. ومع ذلك ، فإن استخدام الأجسام المضادة الفلورية المترافقة مباشرة يمكن أن يمثل تحديا للعلامات الأقل وفرة…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يعترف المؤلفون بتوماس وو لمعالجة ملفات NGS. نشكر جيمس زياي على مناقشات النتائج ومراجعة المخطوطات وميريديث تريبليت وراشيل تايلور على المراجعة الداخلية للمخطوطة.
Materials
| 10x Tris buffered saline (TBS) | Cell Signaling Technologies | 12498S | Diluted to 1x TBS in DEPC treated water |
| Antibody X (not disclosed) | antibody blinded due to confidentiality | ||
| DEPC-treated water | ThermoFisher | AM9922 | Another can be used |
| DISCOVERY Cell Conditioning ( CC1) | Ventana | 950-500 | |
| DISCOVERY Cy5 Kit | Ventana | 760-238 | Referred as Cy5 |
| DISCOVERY FAM Kit | Ventana | 760-243 | Referred as FAM |
| DISCOVERY Goat Ig Block | Ventana | 760-6008 | Referred as Gt Ig Block |
| DISCOVERY OmniMap anti-Ms HRP | Ventana | 760-4310 | Referred as OMap anti-Ms HRP |
| DISCOVERY OmniMap anti-Rb HRP | Ventana | 760-4311 | Referred as OMap anti-Rb HRP |
| DISCOVERY Rhodamine 6G Kit | Ventana | 760-244 | Referred as Rhodamine 6G |
| DISCOVERY ULTRA Automated Slide Preparation System | Ventana | 05 987 750 001 / N750-DISU-FS | Referred as autostainer on the manuscript |
| FAP [EPR20021] Antibody | Abcam | Ab207178 | |
| GeoMx Digital Spatial Profiler | NanoString | GMX-DSP-1Y | Referred as spatial profiling platform on the manuscript |
| Humidity chamber | Simport | M920-2 | Another can be used |
| Pan-Cytokeratin [AE1/AE3] Antibody | Abcam | Ab27988 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant | ThermoFisher | P36934 | |
| Python | Python | Statistical analysis | |
| Reaction Buffer (10x) | Ventana | 950-300 | |
| Statistical analysis software | GraphPad | Prism 7 | Statistical analysis |
| SYTO 64 | ThermoFisher | S11346 | |
| ULTRA Cell Conditioning (ULTRA CC2) | Ventana | 950-223 | |
| Ventana Antibody Diluent with Casein | Ventana | 760-219 | Referred as specified diluent on the manuscript |
| Ventana Primary antibody dispenser | Ventana | Catalog number depends on dispenser number |
References
- Nerurkar, S. N., et al. Transcriptional spatial profiling of cancer tissues in the era of immunotherapy: The potential and promise. Cancers. 12 (9), 2572 (2020).
- Decalf, J., Albert, M. L., Ziai, J. New tools for pathology: a user’s review of a highly multiplexed method for in situ analysis of protein and RNA expression in tissue. Journal of Pathology. 247 (5), 650-661 (2019).
- McGinnis, L. M., Ibarra-Lopez, V., Rost, S., Ziai, J. Clinical and research applications of multiplexed immunohistochemistry and in situ hybridization. Journal of Pathology. 254 (4), 405-417 (2021).
- . NanoString. GeoMx Digital Spatial Profiler Available from: https://nanostring.com/products/geomx-digital-spatial-profiler/geomx-dsp-overview (2022)
- . NanoString. GeoMx Digital Spatial Profiler Available from: https://nanostring.com/wp-content/uploads/BR_MK0981_GeoMx_Brochure_r19_FINAL_Single_WEB.pdf (2022)
- McCart Reed, A. E., et al. Digital spatial profiling application in breast cancer: a user’s perspective. Virchows Arch: An International Journal of Pathology. 477 (6), 885-890 (2020).
- McNamara, K. L., et al. Spatial proteomic characterization of HER2-positive breast tumors through neoadjuvant therapy predicts response. Nature Cancer. 2 (4), 400-413 (2021).
- Kim, S. W., Roh, J., Park, C. S. Immunohistochemistry for pathologists: Protocols, pitfalls, and tips. Journal of Pathology and Translational Medicine. 50 (6), 411-418 (2016).
- Muñoz, N. M., et al. Molecularly targeted photothermal ablation improves tumor specificity and immune modulation in a rat model of hepatocellular carcinoma. Communications Biology. 3 (1), 783 (2020).
- Coleman, M., et al. Hyaluronidase impairs neutrophil function and promotes Group B Streptococcus invasion and preterm labor in nonhuman primates. mBio. 12 (1), 03115-03120 (2021).
- Gupta, S., Zugazagoitia, J., Martinez-Morilla, S., Fuhrman, K., Rimm, D. L. Digital quantitative assessment of PD-L1 using digital spatial profiling. Laboratory Investigation; A Journal of Technical Methods and Pathology. 100 (10), 1311-1317 (2020).
- Carter, J. M., et al. Characteristics and spatially defined immune (micro)landscapes of early-stage PD-L1-positive triple-negative breast cancer. Clinical Cancer Research. 27 (20), 5628-5637 (2021).
- Busse, A., et al. Immunoprofiling in neuroendocrine neoplasms unveil immunosuppressive microenvironment. Cancers. 12 (11), 3448 (2020).
- Kulasinghe, A., et al. Profiling of lung SARS-CoV-2 and influenza virus infection dissects virus-specific host responses and gene signatures. European Respiratory Journal. 59 (1), (2021).
- Li, X., Wang, C. Y. From bulk, single-cell to spatial RNA sequencing. International Journal of Oral Science. 13 (36), (2021).
- Merritt, C. R., et al. Multiplex digital spatial profiling of proteins and RNA in fixed tissue. Nature Biotechnology. 38 (5), 586-599 (2020).
- Van, T. M., Blank, C. U. A user’s perspective on GeoMxTM digital spatial profiling. Immuno-Oncology Technology. 1, 11-18 (2019).
- Introduction to GeoMx Normalization: Protein. White Paper. Nanostring Available from: https://nanostring.com/wp-content/uploads/MK2593_GeoMx_Normalization-Protein.pdf (2020)
- Bergholtz, H., et al. Best practices for spatial profiling for breast cancer research with the geomx spatial profiler. Cancers. 13 (17), 4456 (2021).
- Hwang, W. L., et al. Single-nucleus and spatial transcriptomics of archival pancreatic cancer reveals multi-compartment reprogramming after neoadjuvant treatment. BioRxiv. , (2020).
- Jerby-Arnon, L., et al. Opposing immune and genetic mechanisms shape oncogenic programs in synovial sarcoma. Nature Medicine. 27 (2), 289-300 (2021).
