Summary

Crescimento, Purificação e Titulação do Vírus Herpes Simplex Oncolítico

Published: May 13, 2021
doi:

Summary

Neste manuscrito, descrevemos um método simples de crescimento, purificação e titulação do vírus herpes simplex oncolítico para uso pré-clínico.

Abstract

Os vírus oncolíticos (OVs), como o vírus herpes simplex oncolítico (oHSV), são uma estratégia de tratamento em rápido crescimento no campo da imunoterapia contra o câncer. Os OVs, incluindo oHSV, replicam-se seletivamente e matam células cancerígenas (poupando células saudáveis/normais) ao induzir a imunidade anti-tumor. Devido a essas propriedades únicas, as estratégias de tratamento baseadas em oHSV estão sendo cada vez mais utilizadas para o tratamento do câncer, preclinicamente e clinicamente, incluindo talimogene laherparevec aprovado pela FDA (T-Vec). Crescimento, purificação e titulação são três técnicas essenciais de laboratório para quaisquer OVs, incluindo oHSVs, antes que possam ser utilizados para estudos experimentais. Este artigo descreve um método simples passo a passo para amplificar oHSV em células Vero. À medida que os OHSVs se multiplicam, eles produzem um efeito citopático (CPE) nas células Vero. Uma vez que 90-100% das células infectadas apresentam um CPE, elas são colhidas suavemente, tratadas com cloreto de benzonase e magnésio (TMN2),filtradas e submetidas à purificação usando o método de suênula-gradiente. Após a purificação, o número de oHSV infecciosos (designados como unidades formadoras de placas ou PFUs) é determinado por um “ensaio de placa” em células Vero. O protocolo aqui descrito pode ser usado para preparar estoque de oHSV de alta titulação para estudos in vitro na cultura celular e experimentos in vivo em animais.

Introduction

Os vírus oncolíticos (OVs) são uma forma emergente e única de imunoterapia contra o câncer. Os OVs replicam-se seletivamente em células tumorais e lises (poupando células normais/saudáveis)1 ao induzir imunidade anti-tumor2. O vírus herpes simplex oncolítico (oHSV) é um dos vírus mais estudados entre todos os OVs. É mais distante na clínica, com Talimogene laherparepvec (T-VEC) sendo o primeiro e único OV a receber aprovação da FDA nos EUA para o tratamento de melanoma avançado3. Além do T-VEC, muitos outros oHSVs geneticamente modificados estão sendo testados pré-clínico e clinicamente em diferentes tipos de câncer3,4,5,6,7,8. A atual biotecnologia avançada de DNA recombinante aumentou ainda mais a viabilidade da engenharia de novos oHSVs codificação para transgenes terapêuticos3,5. Um sistema eficiente de propagação, purificação e determinação de oHSV é fundamental antes que qualquer oHSV (recém-desenvolvido) possa ser testado para estudos in vitro e in vivo. Este artigo descreve um método simples passo-a-passo de crescimento oHSV (em células Vero), purificação (pelo método de gradiente de sacarose) e titulação (por um ensaio de placa oHSV em células Vero)(Figura 1). Pode ser facilmente adotado em qualquer configuração de laboratório de Nível 2 (BSL2) de Biossegurança para obter um estoque viral de alta qualidade para estudos pré-clínicos.

Vero, uma linha de células renais de macaco verde africano, é a linha celular mais usada para propagação oHSV9,10,11,12,13 como as células Vero têm uma via de sinalização antiviral defeituosa14. Outras linhas celulares com estimulador inativado de sinais de genes interferon (STING) também podem ser usadas para o crescimento oHSV12,13. Este protocolo utiliza células Vero para o crescimento e ensaio de placas oHSV. Após a propagação, as células infectadas pelo OHSV são colhidas, lised e submetidas à purificação, onde as células lised são tratadas pela primeira vez com nuclease de benzonase para degradar o DNA das células hospedeiras, prevenir a agregação nucleico ácido-proteína e reduzir a viscosidade do lisato celular. Como a ativação adequada da benzonase muitas vezes requer Mg2+, 1-2 mM MgCl2 é usado neste protocolo15. Os detritos de células hospedeiras do lysato celular tratado com benzonase são ainda mais eliminados pela filtragem serial antes da centrifugação de sáuera-gradiente de alta velocidade. Uma almofada viscosa de solução de sacarose de 25% ajuda a garantir uma taxa mais lenta de migração de vírus através da camada de sacarose, deixando componentes relacionados com células hospedeiras no sobrenante, melhorando assim a purificação e limitando a perda de vírus na pelota16. O oHSV purificado é então titulado em células Vero, e placas virais são visualizadas por giemsa manchando17 ou X-gal staining (para LacZ codificando oHSVs)18.

Protocol

1) crescimento do OHSV NOTA: Garantir a aprovação do comitê de biossegurança institucional antes de trabalhar com o OHSV. Este estudo foi realizado sob o Protocolo IBC aprovado nº 18007. Mantenha as precauções BSL2: alvejante todas as tubulações, pontas, tubos e outros materiais que entram em contato com o vírus. Luvas de spray com 70% de álcool isopropílico antes que as mãos deixem o capô de cultura celular BSL2. Lave sempre as mãos com água com sabão depois de trabalhar com um…

Representative Results

Uma breve visão geral de todo o protocolo é retratada na Figura 1, que representa as etapas críticas envolvidas no crescimento, purificação e titulação do oHSV. CPE em células Vero pode ser detectado tão cedo quanto 4 h infecção pós-HSV19. A Figura 2 demonstra cpe em células Vero em três pontos de tempo diferentes após a infecção por OHSV. O nível do CPE é aumentado ao longo do tempo. Neste protocolo, 90-100% CPE é ger…

Discussion

O protocolo começa com o crescimento do oHSV em células Vero de baixa passagem. A confluência da monocamada celular Vero deve ser ~80% no momento da inoculação do vírus, pois as células supercultivadas podem desenvolver estruturas fibrosas apertadas que podem reduzir a entrada de OHSV nas células Vero20. Uma vez observadas 90-100% CPE, a cultura sobrenante é removida, as células são colhidas, resuspended em VB/supernante (ver passo 1.4.6), congelado por snap e armazenado a -80 °C para …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

A pesquisa no laboratório Saha foi apoiada em parte por fundos do DOD (W81XWH-20-1-0702) e da Fundação Dodge Jones-Abilene. Samuel D. Rabkin e Melissa R.M. Humphrey foram parcialmente apoiados pelo NIH (R01 CA160762).

Materials

1.7 mL centrifuge tubes Sigma CLS3620
15 mL polypropylene centrifuge tubes Falcon 352097
5 mL polypropylene tubes Falcon 352063
50 mL polypropylene centrifuge tubes Falcon 352098
6-well cell culture plates Falcon 353046
Benzonase Nuclease Sigma E8263-25KU
Cell scraper Fisher Scientific 179693
Dimethyl sulfoxide Sigma D2650-100ML
Dulbecco’s Modified Eagle Medium Corning MT-10-013-CV
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline Corning MT-21-031-CV
Fetal Bovine Serum Hyclone SH3007003
Giemsa Stain Sigma G3032
Glutaraldehyde Fisher Scientific 50-262-23
Glycerol Sigma G5516
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) Corning MT-21-021-CV
High-Glucose Dulbecco’s Phosphate-buffered Saline Sigma D4031
Human immune globulin Gamastan NDC 13533-335-12
Magnesium chloride Fisher Chemical M33-500
Media Sterilization filter, 250 mL Nalgene, Fisher Scientific 09-740-25E
Media Sterilization filter, 500 mL Nalgene, Fisher Scientific 09-740-25C
Neutral Red solution Sigma N4638
Paraformaldehyde Fisher scientific  15710S
Plate rocker Fisher 88861043
Potassium Ferricyanide Sigma P8131
Potassium Ferrocyanide Sigma P9387
Sodium chloride Fisher Chemical S271-3
Sorvall ST 16R Centrifuge ThermoFisher Scientific 75004381
Sorvall ST 21R Centrifuge ThermoFisher Scientific 75002446
Sterile Microcentrifuge Tubes with Screw Caps Fisher Scientific 02-681-371
Sucrose Fisher Scientific BP220-1
Syringe Filter, 0.45 PVDF MilliporeSigma SLHV033RS
Syringe Filter, 0.8 MCE MilliporeSigma SLAA033SS
Syringe filter, 5 µm PVDF MilliporeSigma SLSV025LS
T150 culture flask Falcon 355001
Tris-HCl MP Biomedicals LLC 816116
Ultrasonic water bath Branson CPX-952-116R
X-gal Corning 46-101-RF

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Cite This Article
Nguyen, H., Sah, N., Humphrey, M. R. M., Rabkin, S. D., Saha, D. Growth, Purification, and Titration of Oncolytic Herpes Simplex Virus. J. Vis. Exp. (171), e62677, doi:10.3791/62677 (2021).

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