عزل نشط Caenorhabditis elegans استخراج النووية وإعادة تشكيل للنسخ في المختبر
Summary
هنا، نقوم بوصف بروتوكول مفصل لعزل المستخلص النووي النشط من المرحلة الرابعة من اليرقات وتصور نشاط النسخ في نظام المختبر .
Abstract
كان Caenorhabditis elegans نظاما نموذجيا مهما للأبحاث البيولوجية منذ عرضه في عام 1963. ومع ذلك، لم يتم استخدام C. elegans بشكل كامل في الدراسة الكيميائية الحيوية للتفاعلات البيولوجية باستخدام مستخلصاتها النووية مثل النسخ المختبري وتكرار الحمض النووي. هناك عقبة كبيرة أمام استخدام سي إليغانس في الدراسات الكيميائية الحيوية هي تعطيل الجلد الخارجي السميك للنيماتودا دون التضحية بنشاط المستخلص النووي. في حين يتم استخدام العديد من الطرق لكسر كتيكل، مثل تجانس دونس أو سونيكيشن، فإنها غالبا ما تؤدي إلى عدم استقرار البروتين. لا توجد بروتوكولات راسخة لعزل البروتينات النووية النشطة عن اليرقات أو البالغين C. elegans لتفاعلات المختبر. هنا ، يصف البروتوكول بالتفصيل تجانس المرحلة 4 C. elegans اليرقات باستخدام متجانس بالش. يستخدم المتجانس بالش الضغط لإجبار الحيوانات ببطء من خلال فجوة ضيقة تكسر السفاح في هذه العملية. يسمح التصميم الموحد والآلات الدقيقة للمتجانس بالش بطحن الحيوانات بشكل متسق بين التجارب. تجزئة المتجانسة التي تم الحصول عليها من المتجانس بالش تسفر عن استخراج النووية النشطة وظيفيا التي يمكن استخدامها في طريقة في المختبر لاقتناص نشاط النسخ من elegans C.
Introduction
الصغيرة، والعيش الحر النيماتودا Caenorhabditis elegans هو كائن نموذجي بسيط ولكن قوية لمعالجة مجموعة واسعة من الأسئلة البيولوجية. منذ إدخالها في عام 1963 ، كانت الديدان الخيطية لا تقدر بثمن للإجابة على الأسئلة في علم الأعصاب والتمثيل الغذائي والشيخوخة والتنمية والمناعة وعلم الوراثة1. بعض من العديد من الخصائص الحيوانية التي تجعل من كائن نموذجي مثالي تشمل وقت الجيل القصير، وفعالية تدخل الحمض النووي الريبي، والجسم الشفاف، والخرائط المكتملة لكل من النسب الخلوي والجهاز العصبي.
في حين أن مساهمات النيماتودا في العلوم واسعة ، إلا أنها لم تستخدم بشكل كاف لتوضيح نظام النسخ النواخي ، مع معظم فهمنا حول هذه الآليات القادمة من الدراسات باستخدام الاستخراج النووي من الخميرة وذبابة الفاكهة وثقافة خلايا الثدييات2. أكبر عقبة تثني الباحثين عن استخراج استخراج نووي وظيفي هو لطيف النيماتود الخارجي الصعب. يتكون هذا الهيكل الخارجي من الكولاجينات المتقاطعة و البشرة و البروتينات الجليكوبروتينية والدهون ، مما يجعل C. elegans من مرحلة اليرقات إلى مرحلة البلوغ مقاوما لاستخراج البروتين عن طريق القوى الكيميائية أو الميكانيكية3. وقد تم تطوير نظام نسخ في المختبر باستخدام مستخلص C. elegans النووي مرة واحدة ولكن لم يتم اعتماده على نطاق واسع بسبب النطاق المحدود للنظام ، واستخدام Dounce homogenizer لإعداد المستخلص يمكن أن يؤدي إلى عدم استقرار البروتين4،5.
على عكس البروتوكول السابق لعزل الاستخراج النووي الذي استخدم متجانس Dounce لكسر C. elegans ، يستخدم هذا البروتوكول متجانس Balch. يتكون المتجانس بالش من مكونين رئيسيين: كرة كربيد التنغستن وكتلة من الفولاذ المقاوم للصدأ مع قناة بالملل من نهاية إلى أخرى. يتم تحميل المتجانس بالش مع الكرة كربيد التنغستن وتوج على جانبي لختم غرفة طحن. يمكن تحميل المحاقن على المنفذين العموديين المؤديين إلى غرفة الطحن. كما يتم تمرير المواد من حقنة واحدة إلى أخرى من خلال غرفة طحن، والضغط من المحاقن يجبر المواد من خلال فجوة ضيقة بين الكرة وجدار الغرفة. هذا الضغط البطيء والمستمر يكسر المادة حتى تصل إلى حجم ثابت قادر على المرور عبر الفجوة الضيقة بسهولة. إجبار C. elegans من خلال الفجوة الضيقة عبر ضغط ثابت بعد لطيف يكسر الحيوانات مفتوحة، والإفراج عن محتواها في المخزن المؤقت المحيطة بها. تبديل أحجام الكرة يزيد من تضييق الفجوة، وكسر الخلايا الصادرة حديثا ويحرر النوى في المخزن المؤقت. وتفصل حالات متعددة من الطرد المركزي النوى عن بقية حطام الخلية، مما يسمح بجمع مستخلص نووي نظيف. ويفضل المتجانس بالش على التجانس Dounce لعدة أسباب: يمكن للنظام التعامل مع عدد كبير من الحيوانات، مما يجعل من الممكن لاستخراج كمية عالية من البروتينات النشطة في محاولة واحدة. الآلات الدقيقة للكرات وكتلة الصلب يسمح لطحن متسقة بين عينات متعددة؛ كتلة الصلب الثقيلة بمثابة بالوعة الحرارة، ورسم الحرارة بشكل موحد بعيدا عن غرفة طحن، ومنع التدهور.
بعد العزل، يجب التحقق من نشاط النسخ المستخلص النووي قبل استخدامه في أي تجارب بيوكيميائية. تقليديا، تم قياس نشاط النسخ باستخدام النيوكليوتيدات التي تم تصنيفها إشعاعيا لتتبع وتصور الحمض النووي الريبي المركب حديثا. ومع ذلك، يمكن أن يكون وضع العلامات المشعة مرهقا لأنه يتطلب الحذر أثناء الاستخدام والتخلص6. تسمح التطورات التكنولوجية للباحثين اليوم باستخدام أساليب أقل ضررا أو إزعاجا لقياس حتى كميات الحمض النووي الريبي الصغيرة باستخدام تقنيات مثل PCR الكمي في الوقت الحقيقي (qRT-PCR)7. هنا، يصف البروتوكول طريقة لعزل الاستخراج النووي النشط من المرحلة اليرقات 4 (L4) C. elegans وتصور نشاط النسخ في نظام المختبر.
Protocol
Representative Results
Discussion
C. elegans هو كائن حي نموذج جذاب لدراسة نظام النسخ eukaryotic بسبب صيانته منخفضة التكلفة وسهولة التلاعب الجيني. هنا يتم وصف بروتوكول لعزل ثابت لاستخراج النووية النشطة وظيفيا من L4 C. elegans . على الرغم من أن هذا البروتوكول ركز على تصور نشاط النسخ ، يمكن قياس CDNA المنتجة بعد النسخ باستخدام RT-qPCR لل…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد تم دعم هذا العمل بمنحة من المعهد الوطني للصحة (R35GM124678 إلى J. S.).
Materials
| Consumables and reagents | |||
| 0.2 mL 8-Strip Tubes & Flat Strip Caps, Clear | Genesee Scientific | 24-706 | |
| 0.2 mL Individual PCR tubes | Genesee Scientific | 24-153G | |
| 1.7 mL sterile microtubes | Genesee Scientific | 24-282S | |
| 100% absolute molecular grade ethanol | Fisher Scientific | BP2818 | |
| 100% ethanol, Koptec | Decon Labs | V1001 | |
| 10 mL serological pipet | VWR international | 89130-898 | |
| 150 mm petri plates | Tritech Research | T3325 | |
| 15 mL conical centrifuge tubes | Genesee Scientific | 28-103 | |
| 20 mL plastic syringes | Fisher Scientific | 14955460 | |
| 2 mL Norm-Ject syringes | Henke-Sass Wolf GmbH | 4020 | |
| 500 mL vacuum filter cup 0.22 µm PES, Stericup Millipore Express Plus | Millipore Sigma | SCGPU10RE | |
| 50 mL conical centrifuge tubes | ThermoFisher Scientific | 339652 | |
| 50 mL serological pipet | VWR international | 89130-902 | |
| 5 mL serological pipet | VWR international | 89130-896 | |
| Agar, Criterion | VWR International | C7432 | |
| Agarose | Denville Scientific | CA3510-6 | |
| Alcohol proof marker | VWR International | 52877-310 | |
| Bacto peptone | VWR International | 90000-264 | |
| Caenorhabditis elegans | CGC | N2 | |
| Calcium dichloride | Millipore Sigma | C4901 | |
| Cholesterol | Millipore Sigma | C8667 | |
| Control DNA temple cloning primers, Forward 5’- ctc atg ttt gac agc tta tcg atc cgg gc -3’ | |||
| Control DNA temple cloning primers, Forward 5’- aca gga cgg gtg tgg tcg cca tga t -3’ | |||
| Deionized water | |||
| Dithiothreitol | Invitrogen | 15508-013 | |
| DNA gel stain, SYBR safe | Invitrogen | S33102 | |
| DNA ladder mix, O’gene ruler | Fisher Scientific | SM1173 | |
| DNA Loading Dye, 6x TriTrack | Fisher Scientific | FERR1161 | |
| DNase, Baseline-ZERO | Lucigen | DB0715K | |
| Dry ice | |||
| Escherichia coli OP50 strain | CGC | OP50 | |
| Glacial acetic acid | Fisher Scientific | A38 | |
| Glycerol | Millipore Sigma | G6279 | |
| HeLa nuclear extract in vitro transcription system, HeLaScribe | Promega | E3110 | |
| Hepes Solution, 1 M Gibco | Millipore Sigma | 15630080 | |
| Hydrochloric acid 37% | Millipore Sigma | P0662 | |
| Hypochlorite bleach | Clorox | ||
| LB Broth | Millipore Sigma | L3022 | |
| Magnesium dichloride | Millipore Sigma | M8266 | |
| Magnesium Sulfate | Millipore Sigma | M7506 | |
| Medium weigh dishes | Fisher Scientific | 02-202-101 | |
| microscope slides, Vista vision | VWR International | 16004-368 | |
| molecular grade water, Hypure | Hyclone Laboratories | SH30538 | |
| Nystatin | Millipore Sigma | N1638 | |
| PCR system, FailSafe with premix A | Lucigen | FS99100 | |
| Potassium chloride | Millipore Sigma | P39111 | |
| Potassium phosphate dibasic | Millipore Sigma | P3786 | |
| Potassium phosphate monobasic | Millipore Sigma | P0662 | |
| Protease inhibitor, Halt single use cocktail 100x | ThermoFisher Scientific | 78430 | |
| protein assay kit, Qubit | ThermoFisher Scientific | Q33211 | |
| reverse transcription kit, Sensiscript | Qiagen | 205211 | |
| RNA extraction kit RNeasy micro kit | Qiagen | 74004 | |
| RNase Inhibitor | Applied Biosystems | N8080119 | |
| Sodium Chloride | VWR International | BDH9286-12KG | |
| Sodium hydroxide | Millipore Sigma | 1-09137 | |
| Sterile syringe filter with 0.2 µm Polyethersulfone membrane | VWR international | 28145-501 | |
| Sucrose | VWR International | 200-334-9 | |
| transcription primers, Forward 5’- gcc ggg cct ctt gcg gga tat -3’ | |||
| transcription primers, Reverse 5’- cgg cca aag cgg tcg gac agt-3’ | |||
| Tris-Base | Fisher Scientific | BP152 | |
| Tween20 | Millipore Sigma | P2287 | |
| Equipment | |||
| -20 °C incubator | ThermoFisher Scientific | ||
| 20 °C incubator | ThermoFisher Scientific | ||
| 37 °C incubator | Forma Scientific | ||
| 4 °C refrigerator | ThermoFisher Scientific | ||
| -80 °C freezer | Eppendorf | ||
| Autoclave | Sanyo | ||
| Balch homogenizer, isobiotec cell homogenizer | Isobiotec | ||
| Benchtop Vortexer | Fisher Scientific | 2215365 | |
| Centrifuge, Eppendorf 5418 R | Eppendorf | 5401000013 | |
| Centrifuge, VWR Clinical 50 | VWR International | 82013-800 | |
| Dissection microscope, Leica M80 | Leica Microsystems | ||
| Fluorometer, Qubit 2.0 | Invitrogen | Q32866 | |
| Gel imaging system, iBright FL1500 | ThermoFisher Scientific | A44241 | |
| Gel system | ThermoFisher Scientific | ||
| Heat block | VWR International | 12621-048 | |
| Microcentrifuges, Eppendorf 5424 | Eppendorf | 22620401 | |
| PIPETBOY acu 2 | Integra | 155017 | |
| Pipette L-1000 XLS+, Pipet-Lite LTS | Rainin | 17014382 | |
| Pipette L-10 XLS+, Pipet-Lite LTS | Rainin | 17014388 | |
| Pipette L-200 XLS+, Pipet-Lite LTS | Rainin | 17014391 | |
| Pipette L-20 XLS+, Pipet-Lite LTS | Rainin | 17014392 | |
| Rocking platform | VWR International | ||
| Thermocycler, Eppendorf Mastercycler Pro | Eppendorf | 950030010 |
References
- Corsi, A. K., Wightman, B., Chalfie, M. A Transparent window into biology: A on Caenorhabditis elegans. 遗传学. 200 (2), 387-407 (2015).
- Blackwell, T. K., Walker, A. K. Transcription mechanisms. WormBook: The Online Review of C. elegans Biology. , 1-16 (2006).
- Page, A. P., Johnstone, I. L. The cuticle. WormBook: The Online Review of C. elegans Biology. , 1-15 (2007).
- Lichtsteiner, S., Tjian, R. Cloning and properties of the Caenorhabditis elegans TATA-box-binding protein. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90 (20), 9673-9677 (1993).
- Lichtsteiner, S., Tjian, R. Synergistic activation of transcription by UNC-86 and MEC-3 in Caenorhabditis elegans embryo extracts. EMBO Journal. 14 (16), 3937-3945 (1995).
- Shan, G., et al. Isotope-labeled immunoassays without radiation waste. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (6), 2445-2449 (2000).
- Voss, C., et al. A novel, non-radioactive eukaryotic in vitro transcription assay for sensitive quantification of RNA polymerase II activity. BMC Molecular Biology. 15, 7 (2014).
- Wibisono, P., Liu, Y., Sun, J. A novel in vitro Caenorhabditis elegans transcription system. BMC Molecular and Cell Biology. 21 (1), 87 (2020).
- Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook: The Online Review of C. elegans Biology. , 1-11 (2006).
- Zbacnik, T. J., et al. Role of buffers in protein formulations. Journal of Pharmaceutical Sciences. 106 (3), 713-733 (2017).
