Markierung extrazellulärer Vesikel zur Überwachung der Migration und Aufnahme in Knorpelexplantaten
Summary
Hier stellen wir ein Protokoll zur Kennzeichnung von extrazellulären Vesikeln aus Thrombozytenlysat vor, um ihre Migration und Aufnahme in Knorpelexplantaten zu überwachen, die als Modell für Osteoarthritis verwendet werden.
Abstract
Extrazelluläre Vesikel (EVs) werden in verschiedenen Studien verwendet, um ihr Potenzial als zellfreie Behandlung aufgrund ihrer Ladung aus ihrer zellulären Quelle, wie z.B. Thrombozytenlysat (PL), nachzuweisen. Wenn sie als Behandlung verwendet werden, wird erwartet, dass EVs in die Zielzellen eindringen und eine Reaktion von diesen bewirken. In dieser Forschung wurden PL-abgeleitete EVs als zellfreie Behandlung von Osteoarthritis (OA) untersucht. So wurde eine Methode entwickelt, um EVs zu kennzeichnen und ihre Aufnahme an Knorpelexplantaten zu testen. PL-abgeleitete EVs werden mit dem lipophilen Farbstoff PKH26 markiert, zweimal durch eine Säule gewaschen und dann in einem in vitro entzündungsgetriebenen OA-Modell für 5 h nach Partikelquantifizierung durch Nanopartikel-Tracking-Analyse (NTA) getestet. Stündlich werden Knorpelexplantate fixiert, paraffiniert, in 6-μm-Abschnitte geschnitten, um sie auf Objektträgern zu montieren, und unter einem konfokalen Mikroskop beobachtet. Dies ermöglicht die Überprüfung, ob EVs während dieser Zeit in die Zielzellen (Chondrozyten) gelangen und ihre direkte Wirkung zu analysieren.
Introduction
Osteoarthritis (OA) ist eine artikuläre degenerative Erkrankung, die eine fortschreitende und irreversible Entzündung und Zerstörung der extrazellulären Matrix des Gelenkknorpelsimpliziert 1. Obwohl verschiedene Formen der Arthritis zahlreiche Behandlungenhaben 2,3,4, sind diese durch ihre Nebenwirkungen und begrenzte Wirksamkeit eingeschränkt. Tissue-Engineering-Techniken unter Verwendung der autologen Chondrozytenimplantation werden routinemäßig zur regenerativen Behandlung von verletztem Knorpel bei frühen OA-Knorpelläsionen angewendet4. Zellbasierte Therapien sind vor allem aufgrund der begrenzten Anzahl von phänotypisch stabilen Chondrozyten oder Chondroprogenitoren eingeschränkt, die in der Lage sind, den Knorpel effektiv zu reparieren3. Daher ist die Entwicklung neuer therapeutischer Strategien zur Verhinderung des Fortschreitens der Krankheit und zur Regeneration großer Knorpelläsionen von größter Bedeutung.
Extrazelluläre Vesikel (EVs) wurden von verschiedenen Autoren als Behandlung für OA vorgeschlagen5,6. EVs sind membranöse Körper, die von der Mehrheit der Zelltypen sezerniert werden, an der interzellulären Signalgebung beteiligt sind und nachweislich die therapeutische Wirkung von Stammzellen ausüben7,8,9, wodurch sie kürzlich Interesse an der regenerativen Medizin geweckt haben10. EVs, die von mesenchymalen Stromazellen (MSCs) abgeleitet sind, sind die wichtigsten therapeutischen EVs, die für OA untersucht wurden, obwohl andere gelenkbezogene Zellen als EV-Quellen verwendet wurden, z. B. Chondroprogenitoren oder Immunzellen11,12.
Thrombozytenkonzentrate, wie Thrombozytenlysate (PLs), werden verwendet, um die Wundheilung bei verschiedenen Verletzungen, wie Hornhautgeschwüren13 , 14,15 oder bei der Sehnengewebsregeneration16zu verbessern , aufgrund der Hypothese, dass die EV-Komponente von Thrombozytenkonzentraten für diese Effekte verantwortlich sein kann17 . Einige Studien im Zusammenhang mit Gelenkerkrankungen verwenden thrombozytenbasierte EVs (PL-EVs) zur Behandlung, um osteoarthritische Zustände zu verbessern. PL-EVs verbessern die Chondrozytenproliferation und Zellmigration, indem sie den Wnt/β-Catenin-Signalweg18aktivieren, die Expression chondogener Marker in osteoarthritischen Chondrozytenfördern 19oder höhere Konzentrationen chondogener Proteine und weniger tissuläre Anomalien bei osteoarthritischen Kaninchen zeigen, die mit PL-EVs behandelt wurden18.
EVs enthalten Proteine, Lipide und Nukleinsäuren, die an die Zielzelle abgegeben werden, wodurch eine Zell-zu-Zell-Kommunikation hergestellt wird, die das Hauptmerkmal im Zusammenhang mit ihren therapeutischen Anwendungen ist20. Die Auswirkungen von Elektrofahrzeugen hängen von ihren erreichenden Zellen und der anschließenden Freisetzung von Fracht ab. Dieser Effekt kann indirekt durch Veränderungen in Zellen bestätigt werden, wie z.B. Stoffwechselaktivität oder Genexpressionsmodifikation. Diese Methoden erlauben jedoch nicht die Visualisierung, wie EVs Zellen erreichen, um ihre Funktion auszuüben. Daher stellt dieses Papier eine Methode zur Kennzeichnung dieser PL-abgeleiteten EVs vor, die zur Behandlung von entzündungsbedingten OA-Knorpel-Explantaten eingesetzt werden sollen. Die konfokale Mikroskopie wurde verwendet, um die EV-Aufnahme und das Fortschreiten zu den in den Explantaten vorhandenen Chondrozyten in einem Zeitraffer von 5 h zu überwachen.
Protocol
Representative Results
Discussion
DIE EV-Bildgebung hilft, ev-Eigenschaften zu verstehen, wie z.B. ihre Freisetzungs- und Aufnahmemechanismen. Ihre Bildgebung ermöglicht die Überwachung ihrer Bioverteilung und die Charakterisierung ihrer pharmakokinetischen Eigenschaften als Wirkstoffvehikel. Die Bildgebung und Verfolgung von Elektrofahrzeugen kann jedoch aufgrund ihrer geringen Größe schwierig sein, obwohl viele bildgebende Geräte und Markierungstechniken entwickelt wurden, um Forschern bei der Überwachung von Elektrofahrzeugen unter In-vitro-…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Forschung wurde vom Instituto de Salud Carlos III, Ministerio de Economía y Competitividad, kofinanziert durch den Europäischen Sozialfonds ESF und den Europäischen Fonds für regionale Entwicklung EFRE (MS16/00124; CP16/00124); durch das PROGRAMA JUNIOR del proyecto TALENT PLUS, construyendo SALUD, generando VALOR (JUNIOR01/18), finanziert durch die nachhaltige Tourismusabgabe der Balearen; von der Direcció General d’Investigació, Conselleria d’Investigació, Govern Balear (FPI/2046/2017); durch das FOLIUM-Postdoktorandenprogramm (FOLIUM 17/01) innerhalb der FUTURMed, das zu 50% aus der Nachhaltigen Tourismussteuer der Balearen und zu 50% aus dem ESF finanziert wird; und vom Comissio de Docencia i Investigacio de la Fundacio Banc de Sang i Teixits de les Illes Balears (CDI21/03).
Materials
| Material | |||
| 1.5 mL Centrifuge tube | SPL life sciences | PLC60015 | |
| 1 mL Syringe BD Plastipak | BD | 303174 | |
| 2-Propanol (Isopropanol) | Panreac AppliChem | 1.310.901.211 | Prepared at 20% with Milli-Q water |
| 96-well culture plate | SPL life sciences | PLC30096 | |
| Absolute ethanol Pharmpur | Scharlab | ET0006005P | Used to prepare 96% and 75% ethanol with Milli-Q water |
| Biopsy Punch with plunger 3 mm | Scandidact | MTP-33-32 | |
| Bovine serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A7030 | Prepared at 5% with PBS |
| Cartilage explants | IdISBa Biobank | ||
| Concentrating tube 15 mL Nanosep 100 kD Omega | Pall | MCP100C41 | |
| Concentrating tube 500 µL Nanosep 100 kD Omega | Pall | OD003C33 | |
| Cover glass 24 x 60 mm | Deltalab | D102460 | |
| DMEM-F12 -GlutaMAX medium | Biowest | L0092 | |
| Dulbecco's PBS (1x) | Capricorn Scientific | PBS-1A | |
| Embedded paraffin tissue blocks | IdISBa Biobank | Fee for service | |
| Exo-spin mini-HD columns | Cell guidance systems | EX05 | |
| Feather S35 Microtome Blade | Feather | 43037 | |
| Filtropur S 0.2 µm syringe filter | Sarstedt | 83.1826.001 | |
| Fluoroshield with DAPI | Sigma-Aldrich | F-6057 | |
| Oncostatin M Human | Sigma-Aldrich | O9635-10UG | Prepare a stock solution to a final concentration of 0.1 µg/µL diluten in PBS-0.1% BSA |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 8.18715.1000 | Prepared at 4% with PBS and stored at 4 °C |
| Penicillin-Streptomycin Solution 100x | Biowest | L0022 | |
| PKH26 Red Fluorescent Cell Linker Kit for General Cell Membrane Labeling | Sigma-Aldrich | MINI26 | PKH26 and Dliuent C included |
| Sodium citrate dihydrate | Scharlab | SO019911000 | |
| Superfrost Plus Microscope Slides | Thermo Scientific | J1800AMNZ | |
| TNFα | R&D systems | 210-TA-005 | Prepare a stock solution to a final concentration of 0.01 µg/µL diluted in PBS-0.1% BSA |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Used to prepare a 0.1% Triton-0.1% sodium citrate solution with Milli-Q water |
| Xylene | Scharlab | XI0050005P | |
| Equipment | |||
| Centrifuge 5430 R | Eppendorf | 5428000210 | F-45-48-11 rotor |
| NanoSight NS300 | Malvern | NS300 | Device with embedded laser at λ= 532 nm and camera sCMOS |
| Shandon Finesse 325 Manual Microtome | Thermo Scientific™ | A78100101 | |
| TCS-SPE confocal microscope | Leica Microsystems | 5200000271 |
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