Determinación de la interacción tripartita entre dos monómeros de un factor de transcripción MADS-box y una proteína sensora de calcio mediante ensayo BiFC-FRET-FLIM
Summary
Aquí presentamos, un método para visualizar la formación de complejos ternarios entre tres socios de proteínas utilizando proteínas marcadas con fluorescentes mediante el ensayo FRET-FLIM basado en BiFC. Este método es valioso para estudiar los complejos de interacción proteína-proteína in vivo.
Abstract
Las interacciones proteína-proteína son una parte integral de todos los procesos biológicos en las células, ya que desempeñan un papel crucial en la regulación, el mantenimiento y la modificación de las funciones celulares. Estas interacciones están involucradas en una amplia gama de fenómenos como la transducción de señales, la respuesta a patógenos, las interacciones célula-célula, los procesos metabólicos y de desarrollo. En el caso de los factores de transcripción, estas interacciones pueden conducir a la oligomerización de las subunidades, secuestrando en contextos subcelulares específicos como el núcleo, el citoplasma, etc., lo que, a su vez, podría tener un efecto más profundo en la expresión de los genes aguas abajo. Aquí, demostramos una metodología para visualizar la interacción tripartita in vivo utilizando la Transferencia de Energía de Resonancia de Förster (FRET) basada en la Complementación de Fluorescencia Bimolecular (BiFC) que involucra Imágenes de Por Vida de Fluorescencia (FLIM). Dos de las proteínas seleccionadas para esta demostración interactúan como socios biFC, y su actividad de fluorescencia reconstituida se utiliza para ensayar FRET-FLIM con el tercer socio. Se han utilizado plantas de Nicotiana benthamiana cultivadas en cámaras de crecimiento de cuatro a cinco semanas de edad como el sistema de planta modelo para esta demostración.
Introduction
Las interacciones proteína-proteína (IBP) forman la base del buen funcionamiento de las células eucariotas mediante la regulación de diversos procesos metabólicos y de desarrollo. Algunos IBP son estables, mientras que otros son de naturaleza transitoria. Las interacciones se pueden clasificar en función del número y tipo de miembros en la interacción, como diméricos, triméricos, tetrámeros homoméricos y heteroméricos1. La identificación y caracterización de las interacciones proteicas puede conducir a una mejor comprensión de las funciones proteicas y las redes reguladoras.
Los factores de transcripción son proteínas que están involucradas en las funciones reguladoras. Regulan la velocidad de transcripción de sus genes aguas abajo uniéndose al ADN. A veces, la oligomerización o formación de complejos de orden superior por proteínas es un requisito previo para llevar a cabo sus funciones2. Los factores de transcripción MADS-box de plantas son genes homeóticos que regulan diversos procesos como la transición floral, el desarrollo de órganos florales, la fertilización, el desarrollo de semillas, la senescencia y el desarrollo vegetativo. Se sabe que forman complejos de orden superior que se unen al ADN3,4. El estudio de las redes PPI entre los factores de transcripción y sus interactores proporciona información sobre la complejidad subyacente a la regulación transcripcional.
La expresión transitoria de proteínas en Nicotiana benthamiana ha sido un enfoque popular para estudiar la localización de proteínas o las interacciones proteína-proteína in vivo5. BiFC y FRET son métodos para estudiar las interacciones proteína-proteína in vivo utilizando sistemas de reportero fluorescente6. Se ha demostrado que una combinación de estas dos técnicas revela la interacción entre tres proteínas7. FreT se mide mediante fotoblanqueo aceptor, emisión sensibilizada y técnica de imágenes de por vida de fluorescencia (FLIM). El ensayo FRET basado en FLIM ha surgido como una herramienta que proporciona cuantificación precisa y especificidad espaciotemporal a las mediciones de transferencia de energía entre dos moléculas en función de sus vidas de fluorescencia8. FLIM mide el tiempo que un fluoróforo permanece en un estado excitado antes de emitir un fotón y es mejor que las técnicas que utilizan medidas de intensidad solas9,10. Además de los sistemas heterólogos como Nicotiana benthamiana y las cáscaras epidérmicas de cebolla, informes más recientes han demostrado el uso de raíces de Arabidopsis y plántulas de arroz jóvenes, etc., para el análisis in vivo de las interacciones proteína-proteína en condiciones nativas11,12.
Además de un sistema de expresión adecuado, la selección de socios que interactúan para los ensayos BiFC y FRET también es crucial para el éxito de este experimento. El PPI entre los socios utilizados en la configuración de BiFC debe validarse utilizando los controles apropiados antes de su uso como socio conjugado en el experimento FRET13. BiFC utiliza la complementación estructural de las partes N- y C-terminal de la proteína fluorescente. Una limitación común en la mayoría, si no en todas, las proteínas fluorescentes utilizadas en los ensayos de BiFC ha sido el autoensamblaje entre los dos fragmentos derivados no fluorescentes, lo que contribuye a la fluorescencia falsa positiva y disminuye la relación señal-ruido (S / N)14. Los desarrollos recientes, incluidas las mutaciones puntuales o la posición de división de la proteína fluorescente, han dado lugar a pares biFC con mayor intensidad, mayor especificidad, alta relación S / N15,16. Estas proteínas fluorescentes también se pueden utilizar para llevar a cabo BiFC dependiendo de la idoneidad del experimento.
Tradicionalmente, CFP y YFP se han utilizado como el par donante y aceptor en experimentos FRET17. Sin embargo, se encontró que YFP o m-citrino son mejores donantes de FRET (cuando se usan con RFP como aceptor) debido al alto rendimiento cuántico (QY) durante la expresión nativa de proteínas objetivo en el sistema radicular de Arabidopsis. La selección de promotores (constitutivos versus nativos/endógenos) y fluoróforos también juegan un papel crucial en el diseño de un exitoso experimento BiFC-FRET-FLIM. Es esencial tener en cuenta que la eficiencia de los donantes fret y la idoneidad de los pares FRET tienden a cambiar con el cambio en el promotor y el sistema biológico que se utiliza para la expresión. El QY del fluoróforo, que se relaciona con su brillo, depende del pH, la temperatura y el sistema biológico en uso. Sugerimos que estos criterios se consideren a fondo antes de elegir el par de fluoróforos para el experimento FRET. El sistema biológico, los promotores y las proteínas utilizadas para este protocolo funcionaron bien con los fluoróforos CFP-YFP para el experimento BiFC FRET-FLIM.
En el presente estudio, incorporamos la característica de FLIM para visualizar la interacción entre tres moléculas de proteína utilizando FRET basado en BiFC. En esta técnica, dos proteínas se etiquetan con proteína YFP dividida y la tercera proteína con PPC. Dado que estábamos interesados en estudiar la interacción de un homodímero de proteína MADS-box (M) con una proteína sensora de calcio (C), estas proteínas fueron marcadas con proteínas fluorescentes en vectores pSITE-1CA y pSITE-3CA18. Dos de los socios que interactúan, en este ensayo, fueron etiquetados con partes N- y C-terminales del YFP en los vectores pSPYNE-35S y pSPYCE-35S19, y su interacción da como resultado la reconstitución del YFP funcional que actúa como aceptor fret para el tercer socio que interactúa, que está etiquetado con CFP (actuando como donante FRET) (Figura 1 ). En este caso particular, el PPI entre dos monómeros M y entre M y C ha sido validado mediante la realización de BiFC en tres sistemas diferentes junto con el sistema de levadura-dos-híbrido. Estos vectores fueron movilizados en la cepa Agrobacterium tumifaciens GV3101 por electroporación. La cepa GV3101 tiene un plásmido Ti desarmado pMP90 (pTiC58DT-DNA) con resistencia a la gentamicina20. Se añadió una cepa p19 Agrobacterium junto con todas las infiltraciones para evitar el silenciamiento detransgenes 21. Recomendamos que las tres proteínas también se utilicen en conformaciones opuestas para validar las interacciones tripartitas.
En esta técnica, hemos empleado FLIM, donde en primer lugar, la vida útil de fluorescencia del donante (vida útil del donante no exprimida) se mide en ausencia de un aceptor. Después de eso, su vida útil se mide en presencia del aceptor (vida del donante apagado). Esta diferencia en las vidas de fluorescencia de los donantes se utiliza para calcular la eficiencia de FRET, que depende del número de fotones que exhiben una reducción en la vida útil de la fluorescencia. A continuación se menciona un protocolo detallado para determinar la formación de un complejo ternario entre tres proteínas cualesquiera expresando transitoriamente las proteínas marcadas con fluorescentes en Nicotiana benthamiana y ensayando su interacción por BiFC-FRET-FLIM.
Protocol
Representative Results
Discussion
El presente protocolo demuestra el uso del ensayo FRET-FLIM basado en BiFC para determinar la formación de un complejo ternario entre dos monómeros de una proteína MADS-box y una proteína sensora de calcio. El protocolo está adaptado de un informe de Y. John Shyu et al. donde han desarrollado un método FRET basado en BiFC para visualizar el complejo ternario formado entre heterodímeros de Fos-Jun y NFAT o p65 utilizando el método de emisión sensibilizada7. Anteriormente, galperin y sus co…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
NB, GG, SB, KC agradecen sinceramente a la Comisión de Becas Universitarias (UGC), UGC-BSR, DBT-INSPIRE y el Consejo de Investigación Científica e Industrial (CSIR) por sus becas de investigación. Afortunadamente, agradecemos al Departamento de Biotecnología (DBT), al Gobierno de la India, al Departamento de Ciencia y Tecnología (DST-FIST), al Gobierno de la India por su apoyo financiero.
Materials
| 1 ml Syringes without needles | Dispovan | - | |
| Acetosyringone | Sigma-Aldrich | D134406 | |
| Gateway LR Clonase II Enzyme mix | Thermo Fischer Scientific | 11791020 | The vectors used in the study are Gateway based |
| Gentamycin Sulphate | Himedia | CMS461 | |
| Kanamycin Sulphate | Himedia | MB105 | |
| MES hydrate | Sigma-Aldrich | M2933 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M2670 | |
| pENTR/D-TOPO Cloning Kit | Thermo Fischer Scientific | K240020 | The vectors used in the study are Gateway based |
| Phusion high fidelity Taq DNA polymerase | Thermo Fischer Scientific | F530-S | Any High fidelity Polymerase can work |
| Rifampicin | Himedia | CMS1889 | |
| SP8 FALCON Confocal laser scanning microscope | Leica | SP8 FALCON | Any CLSM with FLIM capabilities can be used for this analysis |
| Spectinomycin dihydrochloride pentahydrate | Himedia | TC034 |
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