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生物工程

光気化したパーフルオロカーボンナノ液滴の定式化と音響変調

Published: July 16, 2021
doi:
10.3791/62814
, ,
1Department of Biomedical Engineering,Georgia Institute of Technology and Emory University, 2School of Electrical Engineering,Georgia Institute of Technology, 3Department of Biomedical Engineering and School of Electrical Engineering,Georgia Institute of Technology and Emory University

Summary

光学的に活性化されたパーフルオロカーボンナノ液滴は、血管系外のイメージングアプリケーションで有望です。この記事では、これらの粒子を合成し、ポリアクリルアミドファントムを架橋し、液滴を音響的に変調して信号を強化する方法を示します。

Abstract

マイクロバブルは、超音波で最も一般的に使用されるイメージング造影剤です。しかしながら、それらのサイズのために、それらは血管区画に限定される。これらのマイクロバブルは、凝縮またはパーフルオロカーボンナノ液滴(PFCnD)として製剤化することができ、それらは浸出するのに十分小さく、次いで標的部位で音響的に誘発される。これらのナノ粒子は、近赤外有機色素またはナノ粒子(例えば、硫化銅ナノ粒子または金ナノ粒子/ナノロッド)などの光学吸収剤を含むことによってさらに強化することができる。光学的にタグ付けされたPFCnDは、光液滴気化(ODV)として知られるプロセスでレーザー照射によって気化することができます。この活性化プロセスにより、画像診断用の最大機械的指数閾値未満では音響的に気化できない高沸点パーフルオロカーボンコアの使用が可能になります。高沸点コアは、気化後に再凝縮する液滴をもたらし、その結果、気化後に一時的にコントラストを生成する「点滅」PFCnDがナノ液滴形態に凝縮します。このプロセスを繰り返してオンデマンドでコントラストを生成できるため、光学変調と音響変調の両方を通じて、バックグラウンドフリーのイメージング、多重化、超解像、コントラスト強調が可能になります。この記事では、プローブ超音波処理を利用して光学的にトリガー可能な脂質シェルPFCnDを合成し、ナノ液滴を特徴付けるためにポリアクリルアミドファントムを作成し、ODV後にPFCnDを音響的に変調してコントラストを改善する方法を示します。

Introduction

マイクロバブルは、軟部組織と比較して生体適合性と優れたエコー源性により、最もユビキタスな超音波造影剤です。これにより、血流、臓器の描写、およびその他のアプリケーションを視覚化するための貴重なツールになります1。ただし、そのサイズ(1〜10μm)は、共振周波数に基づくイメージングには例外的であり、血管系2への適用を制限します。

この制限により、液体パーフルオロカーボンコアの周りに包まれた界面活性剤で構成されるナノエマルジョンであるPFCnDが開発されました。これらのナノ粒子は、200nmという小さなサイズで合成することができ、腫瘍血管系に見られる「漏れやすい」血管系または細孔および開いた開窓を利用するように設計されています。これらの破壊は腫瘍依存性であるが、この透過性は、腫瘍に応じて~200nm〜1.2μmのナノ粒子の溢出を可能にする3,4。それらの初期形態では、これらの粒子は超音波コントラストをほとんどまたはまったく生成しない。音響的または光学的に誘導される気化により、コア相は液体から気体に変化し、直径5,6,7の2.5倍から5倍の増加を誘発し、光音響および超音波コントラストを生成します。音響気化は最も一般的な活性化方法ですが、このアプローチでは、気化のイメージングを制限する音響アーチファクトが作成されます。さらに、ほとんどのパーフルオロカーボンは、8を気化させるために安全閾値を超える機械的指数を有する集束超音波を必要とする。これにより、マイクロバブルをナノ液滴に凝縮することによって合成できる低沸点PFCnDsが開発されました9。しかしながら、これらの液滴はより揮発性であり、自然気化を受けやすい10。

一方、光液滴気化(ODV)は、ナノ粒子11,12,13や色素6,14,15などの光学トリガーの添加を必要とし、ANSI安全限界11内のフルエンスを使用して高沸点のパーフルオロカーボンを気化させることができる。高沸点コアで合成されたPFCnDはより安定であり、気化後に再凝縮するため、バックグラウンドフリーイメージング16、マルチプレックス17、および超解像18が可能になります。これらの技術の主な制限の1つは、高沸点PFCnDが気化後のエコー源性であり、ミリ秒19のスケールの短い時間枠であり、比較的暗いという事実です。この問題は、気化と平均化を繰り返すことで軽減できますが、液滴信号の検出と分離は依然として課題です。

パルス反転からインスピレーションを得て、持続時間およびコントラストは、超音波画像化パルス19の位相を変更することによって増強することができる。希薄化相(nパルス)で超音波イメージングパルスを開始することにより、気化したPFCnDの持続時間とコントラストの両方が増加します。対照的に、超音波イメージングパルスを圧縮位相(pパルス)で開始すると、コントラストが低下し、持続時間が短くなります。この記事では、イメージングで一般的に使用される光学的にトリガー可能なパーフルオロカーボンナノ液滴、ポリアクリルアミドファントムを合成する方法について説明し、音響変調によるコントラストの向上と信号寿命の向上を実証します。

Protocol

1.パーフルオロカーボンナノ液滴製剤 10 mLの丸底フラスコをクロロホルムで洗い流し、10 μLと1 mLの気密ガラスシリンジをクロロホルムで洗い流します。注意: クロロホルムは揮発性であり、吸入すると有毒になる可能性があります。この溶剤を使ったすべての作業は、ドラフト内で行う必要があります。 シリンジを使用して、200 μLのDSPE-mPEG2000(25 mg/mL)、6.3 μLの1,2-ジステア?…

Representative Results

PFCnDの製剤化と遠心分離が成功すると、直径200〜300 nmのサイズの液滴が得られるはずです(図1A)。不適切に分離された液滴は、1μm付近に小さなピークを示すことがあります。これらの溶液は、より大きな液滴を分解するためにさらに浴超音波処理することができる。液滴のサイズは、オストワルド熟成21,22として知られるプロ?…

Discussion

プローブ超音波処理は、PFCnDを作製するための比較的簡単で習得しやすい方法です。注意が必要ないくつかのステップがあります。クロロホルムを取り扱う際には、揮発性であり、標準的な空気置換ピペットから「漏れる」ため、容積式ピペットまたはガラスシリンジを使用することが不可欠です。さらに、正の変位を使用する場合は、クロロホルムがほとんどのプラスチックチップを溶解?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

この研究の一部は、BCRF-20-043の助成金の下で乳がん研究財団によって支援されました。

Materials

Ammonium Persulfate (APS) VWR 97064-592
1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DSPC) Avanti Polar Lipids 850365C Lipids, these can be purchased suspended in chloroform or in powder form. For long term storage, powder form is the best but chloroform is more practical.
1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000] (ammonium salt) (DSPE-PEG) Avanti Polar Lipids 880120C Lipids, these can be purchased suspended in chloroform or in powder form. For long term storage, powder form is the best but chloroform is more practical.
Acrylamide : Bisacrylamide solution (19:1) 40% (w/v), OmniPur® VWR EM-1300 acrylamide solution, lower concentration/ powder
IR-1048 Sigma 405175 Infrared dye
L11-4v Verasonics – ultrasound linear array transducer
Microtip 1/8" Qsonica LLC 4418 microtip for probe sonicator
N, N, N′, N′ -Tetramethylethylenediamine (TEMED) VWR 97064-902 Used to polymerize polyacrylamide by forming free radicals in the presence of ammonium persulfate
Nova II Ophir-Spiricon 7Z01550 laser power meter
Perfluorohexane Fluoromed APF-60M perfluorocarbon liquid
Phosphate buffered saline (PBS) tablets VWR 97062-732 Tablets used to make PBS
Q500 Qsonica LLC Q500-110 Probe sonicator
Silica gel Sigma-Aldrich 288500 2-25 μm particle size
Tempest 30 New wave research – Pulsed laser system
Vantage 128 Verasonics – research ultrasound imaging system
Zetasizer Nano ZS Malvern Instruments Ltd – Makes size measurements based on dynamic light scattering
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References

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Zhao, A., Lee, J., Emelianov, S. Formulation and Acoustic Modulation of Optically Vaporized Perfluorocarbon Nanodroplets. J. Vis. Exp. (173), e62814, doi:10.3791/62814 (2021).
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