Registrazione dell'attività di rete nei circuiti nocicettivi spinali utilizzando array di microelettrodi
Summary
Viene delineato l’uso combinato della tecnologia microelectrode array e della stimolazione chimica indotta da 4-aminopiridina per studiare l’attività nocicettiva a livello di rete nel corno dorsale del midollo spinale.
Abstract
I ruoli e la connettività di specifici tipi di neuroni all’interno del corno dorsale del midollo spinale (DH) vengono delineati a un ritmo rapido per fornire una visione sempre più dettagliata dei circuiti alla base dell’elaborazione del dolore spinale. Tuttavia, gli effetti di queste connessioni per una più ampia attività di rete nel DH rimangono meno ben compresi perché la maggior parte degli studi si concentra sull’attività di singoli neuroni e piccoli microcircuiti. In alternativa, l’uso di array di microelettrodi (MEA), in grado di monitorare l’attività elettrica su molte cellule, fornisce un’elevata risoluzione spaziale e temporale dell’attività neurale. Qui, viene descritto l’uso di MEA con fette di midollo spinale di topo per studiare l’attività dh indotta da circuiti DH chimicamente stimolanti con 4-aminopiridina (4-AP). L’attività ritmica risultante è limitata al DH superficiale, stabile nel tempo, bloccata dalla tetrodotossina, e può essere studiata in diversi orientamenti delle fette. Insieme, questa preparazione fornisce una piattaforma per studiare l’attività del circuito DH nei tessuti di animali naïve, modelli animali di dolore cronico e topi con funzione nocicettiva geneticamente alterata. Inoltre, le registrazioni MEA in fette di midollo spinale stimolate da 4-AP possono essere utilizzate come strumento di screening rapido per valutare la capacità di nuovi composti antinocicettivi di interrompere l’attività nel DH del midollo spinale.
Introduction
I ruoli di specifici tipi di interneuroni inibitori ed eccitatori all’interno del DH del midollo spinale vengono scoperti ad un ritmo rapido 1,2,3,4. Insieme, gli interneuroni costituiscono oltre il 95% dei neuroni nel DH e sono coinvolti nell’elaborazione sensoriale, compresa la nocicezione. Inoltre, questi circuiti interneuronici sono importanti per determinare se i segnali periferici salgono sul neuroassi per raggiungere il cervello e contribuire alla percezione del dolore 5,6,7. Ad oggi, la maggior parte degli studi ha studiato il ruolo dei neuroni DH a livello di analisi a singola cellula o intero organismo utilizzando combinazioni di elettrofisiologia intracellulare in vitro, etichettatura neuroanatomica e analisi comportamentale in vivo 1,3,8,9,10,11,12,13,14 . Questi approcci hanno notevolmente migliorato la comprensione del ruolo di specifiche popolazioni di neuroni nell’elaborazione del dolore. Tuttavia, rimane una lacuna nella comprensione di come specifici tipi di cellule e piccoli macro-circuiti influenzino grandi popolazioni di neuroni a livello di microcircuito per modellare successivamente l’output del DH, le risposte comportamentali e l’esperienza del dolore.
Una tecnologia in grado di studiare la funzione macro-circuito o multicellulare è il microelectrode array (MEA)15,16. I MEA sono stati utilizzati per studiare la funzione del sistema nervoso per diversi decenni17,18. Nel cervello, hanno facilitato lo studio dello sviluppo neuronale, della plasticità sinaptica, dello screening farmacologico e dei test di tossicità17,18. Possono essere utilizzati sia per applicazioni in vitro che in vivo, a seconda del tipo di MEA. Inoltre, lo sviluppo dei MEA si è evoluto rapidamente, con diversi numeri di elettrodi e configurazioni ora disponibili19. Un vantaggio chiave dei MEA è la loro capacità di valutare simultaneamente l’attività elettrica in molti neuroni con elevata precisione spaziale e temporale tramite più elettrodi15,16. Ciò fornisce una lettura più ampia di come i neuroni interagiscono in circuiti e reti, in condizioni di controllo e in presenza di composti applicati localmente.
Una sfida dei preparati DH in vitro è che i livelli di attività in corso sono in genere bassi. Qui, questa sfida viene affrontata nei circuiti DH del midollo spinale utilizzando il bloccante del canale K + voltaggio-gated, 4-aminopryidine (4-AP), per stimolare chimicamente i circuiti DH. Questo farmaco è stato precedentemente utilizzato per stabilire l’attività elettrica sincrona ritmica nel DH di fette acute del midollo spinale e in condizioni acute in vivo 20,21,22,23,24. Questi esperimenti hanno utilizzato patch monocellulare e registrazione extracellulare o imaging del calcio per caratterizzare l’attività indotta da 4-AP 20,21,22,23,24,25. Insieme, questo lavoro ha dimostrato il requisito della trasmissione sinaptica eccitatoria e inibitoria e delle sinapsi elettriche per l’attività ritmica indotta da 4-AP. Pertanto, la risposta 4-AP è stata vista come un approccio che smaschera i circuiti DH polisinaptici nativi con rilevanza biologica piuttosto che come un epifenomeno indotto da farmaci. Inoltre, l’attività indotta da 4-AP mostra un profilo di risposta simile ai farmaci analgesici e antiepilettici come le condizioni di dolore neuropatico ed è stata utilizzata per proporre nuovi bersagli farmacologici analgesici a base spinale come le connessioni 20,21,22.
Qui, viene descritta una preparazione che combina MEA e attivazione chimica del DH spinale con 4-AP per studiare questo circuito nocicettivo al macro-circuito, o a livello di rete di analisi. Questo approccio fornisce una piattaforma stabile e riproducibile per studiare i circuiti nocicettivi in condizioni ingenue e neuropatiche “simili al dolore”. Questa preparazione è anche facilmente applicabile per testare l’azione a livello circuitale di analgesici noti e per lo screening di nuovi analgesici nel midollo spinale iperattivo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nonostante l’importanza del DH spinale nella segnalazione nocicettiva, nell’elaborazione e nelle conseguenti risposte comportamentali ed emotive che caratterizzano il dolore, i circuiti all’interno di questa regione rimangono poco compresi. Una sfida chiave nello studio di questo problema è stata la diversità delle popolazioni di neuroni che comprendono questi circuiti 6,31,32. I recenti progressi nelle tecnologie transgeniche…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato finanziato dal National Health and Medical Research Council (NHMRC) dell’Australia (sovvenzioni 631000, 1043933, 1144638 e 1184974 a B.A.G. e R.J.C.) e dall’Hunter Medical Research Institute (sovvenzione a B.A.G. e R.J.C.).
Materials
| 4-aminopyridine | Sigma-Aldrich | 275875-5G | |
| 100% ethanol | Thermo Fisher | AJA214-2.5LPL | |
| CaCl2 1M | Banksia Scientific | 0430/1L | |
| Carbonox (Carbogen – 95% O2, 5% CO2) | Coregas | 219122 | |
| Curved long handle spring scissors | Fine Science Tools | 15015-11 | |
| Custom made air interface incubation chamber | |||
| Foetal bovine serum | Thermo Fisher | 10091130 | |
| Forceps Dumont #5 | Fine Science Tools | 11251-30 | |
| Glucose | Thermo Fisher | AJA783-500G | |
| Horse serum | Thermo Fisher | 16050130 | |
| Inverted microscope | Zeiss | Axiovert10 | |
| KCl | Thermo Fisher | AJA383-500G | |
| Ketamine | Ceva | KETALAB04 | |
| Large surgical scissors | Fine Science Tools | 14007-14 | |
| Loctite 454 Instant Adhesive | Bolts and Industrial Supplies | L4543G | |
| MATLAB | MathWorks | R2018b | |
| MEAs, 3-Dimensional | Multichannel Systems | 60-3DMEA100/12/40iR-Ti, 60-3DMEA200/12/50iR-Ti | 60 titanium nitride (TiN) electrodes with 1 internal reference electrode, organised in an 8×8 square grid. Electrodes are 12 µm in diameter, 40 µm (100/12/40) or 50 µm (200/12/50) high and equidistantly spaced 100 µm (100/12/40) or 200 µm (200/12/50) apart. |
| MEA headstage | Multichannel Systems | MEA2100-HS60 | |
| MEA interface board | Multichannel Systems | MCS-IFB 3.0 Multiboot | |
| MEA net | Multichannel Systems | ALA HSG-MEA-5BD | |
| MEA perfusion system | Multichannel Systems | PPS2 | |
| MEAs, Planar | Multichannel Systems | 60MEA200/30iR-Ti, 60MEA500/30iR-Ti | 60 titanium nitride (TiN) electrodes with 1 internal reference electrode, organised in either a 8×8 square grid (200/30) or a 6×10 rectangular grid (500/30). Electrodes are 30 µm in diameter and equidistantly spaced 200 µm (200/30) or 500 µm (500/30) apart. |
| MgCl2 | Thermo Fisher | AJA296-500G | |
| Microscope camera | Motic | Moticam X Wi-Fi | |
| Multi Channel Analyser software | Multichannel Systems | V 2.17.4 | |
| Multi Channel Experimenter software | Multichannel Systems | V 2.17.4 | |
| NaCl | Thermo Fisher | AJA465-500G | |
| NaHCO3 | Thermo Fisher | AJA475-500G | |
| NaH2PO4 | Thermo Fisher | ACR207805000 | |
| Rongeurs | Fine Science Tools | 16021-14 | |
| Small spring scissors | Fine Science Tools | 91500-09 | |
| Small surgical scissors | Fine Science Tools | 14060-09 | |
| Sucrose | Thermo Fisher | AJA530-500G | |
| Superglue | cyanoacrylate adhesive | ||
| Tetrodotoxin | Abcam | AB120055 | |
| Vibration isolation table | Newport | VH3048W-OPT | |
| Vibrating microtome | Leica | VT1200 S |
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