Este protocolo introduz etapas da análise de metabarcoco, visando genes de rRNA 16S e 18S rRNA, para monitoramento de flores algas nocivas e seu microbioma associado em amostras de água do mar. É uma poderosa ferramenta molecular, mas requer vários procedimentos, que são explicados visualmente passo a passo.
O monitoramento de algas nocivas (HABs) tem sido implementado em todo o mundo, e o Chile, um país famoso por sua pesca e aquicultura, tem usado intensamente análises microscópicas e toxinas por décadas para esse fim. Métodos biológicos moleculares, como sequenciamento de DNA de alto rendimento e abordagens baseadas em montagem bacteriana, estão apenas começando a ser introduzidos no monitoramento chileno de HAB, e os procedimentos ainda não foram padronizados. Aqui, são introduzidas análises de metabar codificação de rRNA de 16S e 18S para monitoramento de HABs chilenos. De acordo com uma hipótese recente, a associação mutualista alga-bacteriana desempenha uma relação sinérgica crítica ou antagônica, contabilizando a iniciação, manutenção e regressão da floração. Assim, o monitoramento do HAB a partir de perspectivas algas-bacterianas pode fornecer uma compreensão mais ampla dos mecanismos de HAB e a base para o alerta precoce. A análise de metabarco é uma das ferramentas moleculares mais adequadas para este fim, pois pode detectar informações taxonômicas algal-bacterianas maciças em uma amostra. Os procedimentos visuais de amostragem para análise de metabarcocosinufem instruções específicas, visando reduzir erros e coleta de dados confiáveis.
Muitas espécies de fitoplâncton marinho são conhecidas por produzir toxinas endógenas, e quando essas espécies se acumulam em número suficiente, elas são prejudiciais ao ambiente marinho. Tais Flores algas nocivas (HABs) são observadas hoje nas costas da maioria dos continentes do mundo1. Fitoplâncton tóxico se acumula pela primeira vez em tecidos bivalve, levando a doenças e morte em níveis tróficos mais altos de organismos, incluindo humanos, após a digestão. Posteriormente, esses eventos trazem graves implicações para a economia local, a socioeconomia e a saúde pública2. Estima-se que os danos à economia global causados pelos HABs sejam de milhões a bilhões de dólares a cada ano3. O Chile é um dos muitos países que sofrem de HABs frequentes.
O Chile é um país de terras longas, que se estende por mais de 4.300 km ao norte e ao sul. A terra ocidental alongada enfrenta o Oceano Pacífico, o que naturalmente aumenta as chances do Chile experimentar HABs. Especialmente no sul do Chile, existem muitas aquiculturas de salmão mundialmente famosas, e toda vez que um HAB ocorre na região, as toxinas algas resultam em salmão de criação maciça adoecendo e morrendo4,5,6. No Chile, o ano em que o HAB mais atingiu a economia foi 2016, com um prejuízo anual estimado em US$ 800 milhões7,8. As espécies de algas tóxicas causais variam de acordo com o ano e a localização. Para o caso de 2016, um complexo de Alexandrium catanella e Pseudochattonella verruclosa causou um HAB generalizado na maior parte da costa sul do Chile7,8. O HAB mais recente no Chile ocorreu com a espécie de algas causais de Heterosigma Akashiwo em março de 2021 em Camanchaca, localizada no sul do Chile, onde a área tem uma grande fazenda de salmão.
O Chile vem realizando monitoramento costeiro há muitos anos usando dois métodos principais; observando a água do mar com microscópios para identificar espécies de algas tóxicas regularmente e medindo os níveis de toxinas em mariscos por ensaios bioquímicos9. A detecção precoce de algas tóxicas e os níveis de toxinas em mariscos não previnem HABs; no entanto, essas análises podem desencadear contramedidas imediatas e reduzir danos às comunidades locais. Para fortalecer ainda mais a eficácia dessa estratégia, um método analítico de base molecular foi recentemente adicionado ao nosso programa convencional de monitoramento de HAB chileno para detectar algas e comunidades bacterianas relacionadas em amostras de água do mar. Especificamente, foi escolhido um método de sequenciamento paralelo maciço usando metabar codificação que tem como alvo os genes rRNA e 18S rRNA 16S. Embora esta técnica exija procedimentos complicados e máquinas e reagentes caros, é uma tecnologia avançada que pode detectar milhares de algas e bactérias genera/espécies presentes em uma amostra de água do mar ao mesmo tempo.
Especula-se que as causas do HAB sejam diversas, como temperatura e estação, mas é impossível generalizá-las. Isso porque as espécies e frequências hab dependem da região e das condições espátulas, envolvendo fenômenos naturais como singularidade geográfica, mistura de nutrientes e escoamento de elementos da terra devido a errosion2,10,11,12. Além disso, fatores artificiais como a eutrofização influenciam as HABs locais12,13. Devido ao complexo multifator, não é fácil fazer uma previsão precisa de HAB. Nos últimos anos, há uma visão de que populações bacterianas específicas podem estar relacionadas ao desenvolvimento de HABs como um dos fatores, e pesquisas para apoiar essa hipótese têm sido cada vez mais evidentes14,15,16,17,18. As técnicas de biologia molecular são geralmente usadas para estudar o conjunto bacteriano; no entanto, esse método padronizado ainda não foi estabelecido no monitoramento do HAB chileno9. Para estudar a associação algas-bacterianas com os HABs, é imprescindível realizar simultaneamente análises de metabarcote para os atuais programas de monitoramento costeiro chilenos. Assim, este protocolo apresenta visualmente nosso programa de monitoramento do HAB chileno, com foco em um procedimento passo a passo para analisar a detecção de algas e espécies de bactérias em amostras de água do mar usando análise de metabarco.
O protocolo completo que descreve nosso programa de monitoramento hab chileno está disponível em Yarimizu et al.9. Inclui os procedimentos de amostragem de água do mar, detecção microscópica de espécies algas, detecção de genes algas-bacterianas, análise de pigmentos, coleta de dados meteorológicos e ensaios de propriedades físicas e químicas da água. O protocolo stepwise de análise de metabar codificação de rRNA e 18S rRNA 16S para detecção de espécies algas e bacterianas está disponível como uma pré-impressão19. Este protocolo demonstra particularmente as etapas de análise de metabarcoco, uma vez que é a parte mais complicada e o destaque do nosso programa de monitoramento HAB. Este protocolo também inclui a introdução do programa e a detecção de microscopia de espécies algas. Ao analisar espécies algas por metabar codificação, é crucial realizar simultaneamente microscopia para verificar os resultados dos dois métodos. Este protocolo não inclui como usar software para atribuição de taxonomia, mas a recomendação do banco de dados é brevemente declarada no final da seção a seguir.
Este protocolo realizou com sucesso a análise de metabarcocote de genes 18S rRNA e 16S rRNA para identificar espécies algas e bacterianas em amostras de água do mar para monitoramento de HABs chilenos. As algas dominantes e algumas algas menores detectadas por este protocolo foram consistentes com as obtidas por microscopia, confirmando a confiabilidade do protocolo. O destaque do protocolo é que a análise detectou Alexandrium spp. e Pseudochattonella spp., as duas espécies mais problemáticas causadores de HAB no sul do Chile, a partir da água do mar de Metri mesmo em baixa abundância. Especialmente, Pseudochattonella Spp. são espécies desafiadoras para identificar sob um microscópio porque as células são pequenas e facilmente rompidas sob a luz ou uso de fixativos27,28. A metabar codificação pode fornecer informações de espécies algas que dificilmente estão presentes em amostras de água do mar que a microscopia não pode identificar. O protocolo também detectou mais de 30 espécies bacterianas. Embora a forma como essas bactérias estejam relacionadas ao crescimento de algas seja desconhecida neste momento, a coleta maciça de dados de espécies algas bacterianas na análise da série temporal possivelmente fornecerá descobertas tão importantes. Assim, a adição de análises de metabarco aos programas convencionais de monitoramento de HAB chilenos, sem dúvida, fortalecerá a atual eficiência de monitoramento de HAB. De fato, este protocolo visual para análise de metabarcococo pode ser benéfico não apenas para o monitoramento algal-bacteriano da água chilena, mas também para os programas de monitoramento da costa em outras áreas afetadas pelo HAB em todo o mundo.
Embora este protocolo tenha proporcionado as vantagens acima indicadas, as desvantagens do método devem ser discutidas. Como visto no protocolo visual, o método de metabar codificação é demorado e complexo, exigindo máquinas e reagentes caros. O pessoal do laboratório deve ser especialmente treinado, ou vai desperdiçar material, trabalho e tempo. Além disso, a detecção de algas por metabarificação deve ser emparelhada com microscopia para verificar se as mesmas espécies dominantes são identificadas a partir dos dois métodos ortogonais29. A microscopia é uma ferramenta não invasiva, em sua maioria, para identificar espécies algas, o que significa que é mais difícil cometer erros quando as espécies de algas têm formas únicas e aparentes. É claro que o erro humano pode ocorrer se a espécie tiver formas muito semelhantes umas às outras. Por outro lado, uma vez que a análise de metabarcocos requer múltiplas etapas, ela naturalmente aumenta os erros. Pode ser uma amostra misturada, adição errada de reagente, ou falta de alguns procedimentos. Portanto, é fundamental comparar os resultados de metabarco com os obtidos por microscopia. Por fim, o protocolo é aplicável apenas qualitativamente, e os resultados devem ser calculados para abundância relativa. Como lamb et al. afirmaram em 2019, a metabar codificação atual como o desempenho quantitativo ainda é limitado, e pesquisas adicionais são necessárias antes que a metabarificação possa ser utilizada com confiança para aplicações quantitativas30.
Este protocolo foi otimizado para 140 – 170 amostras por execução do manual de preparação da biblioteca metagenômica 16S emitido pela Illumina Inc. O protocolo otimizado foi testado muitas vezes e modificado para emitir esta versão final. Portanto, é altamente recomendável seguir cada passo com precisão. A parte mais crítica do protocolo é que é necessário um cuidado extra para evitar a contaminação da amostra. As pipetas e a coifa de fluxo laminar devem ser limpas com 70% de álcool e exposição uv o tempo todo, e os materiais esterilizáveis devem ser autoclavados. Os primers e reagentes devem ser diluídos diretamente do estoque a cada nova corrida, ou reutilização de reagentes e exposição a várias diluições pode ser uma causa de contaminação amostral. O protocolo especifica quando a operação pode ser feita fora do capô de fluxo laminar. A menos que o contrário, as amostras devem ser tratadas em um capô de fluxo laminar limpo. Ao lidar com várias tiras de 8 tubos simultaneamente, recomenda-se trabalhar na primeira tira de 8 tubos e tampá-la antes de se mover para a próxima tira de 8 tubos. Deixar a tampa aberta por muito tempo pode causar contaminação amostral, pois os genes 16S e 18S rRNA são altamente onipresentes no ambiente. O tempo indicado, como tempo de mistura e tempo de incubação, deve ser seguido como exatamente descrito porque a melhor duração para cada etapa foi selecionada com base nas múltiplas corridas de teste. O tempo excessivo ou insuficiente pode, por exemplo, reduzir o rendimento amostral. O processo deve ser interrompido apenas na parte que o protocolo diz que pode parar. É crucial ter um controle negativo, pois confirma que os resultados positivos não são falsos positivos artificiais. Por fim, é altamente recomendável planejar os dias porque requer pelo menos cinco dias para processar todas as etapas, e algumas peças não podem ser paradas até o próximo sinal de parada.
A limitação da atribuição taxonômica para dados sequenciados é brevemente observada aqui. Sequências de nucleotídeos recém-descobertas para espécies bacterianas e algas são atualizadas diariamente no banco de dados. Embora espécies algas e bacterianas bem estudadas sejam registradas de forma confiável, há também muitas sequências para espécies desconhecidas atualizadas no banco de dados. Indica que a resolução de sequências de nucleotídeos registradas nem sempre é suficiente para identificação de espécies, mas apenas para identificação do gênero. Assim, a identificação microscópica das espécies deve ser realizada ortogonicamente. Estabelecer um pipeline de acesso aberto para este trabalho tem uma vantagem significativa em lidar com um grande conjunto de dados sequenciados ao mesmo tempo e investigar eficientemente quando ocorre um erro. Além disso, a saída do DADA2 está em um texto ou arquivo csv, o que facilita a análise estatística posterior. Por outro lado, um servidor grande é necessário para executar atribuições taxonômicas, especialmente quando um conjunto de dados é grande. Para montar o pipeline, os engenheiros são necessários para configurar o pipeline, e os profissionais devem entender parâmetros, operação, Linux e bioinformática.
Além do escopo como ferramenta de monitoramento hab, o uso deste protocolo pode ser expandido para fins de pesquisa investigativa. Por exemplo, há debates em andamento entre o governo chileno e pescadores locais, juntamente com as associações de paz ambiental sobre o aumento do número de HAB31locais ,32. O governo afirma que é devido a um fenômeno natural como o aquecimento global e o El Niño, enquanto as partes posteriores afirmam que a aquicultura de salmão é a causa. O salmão não é uma espécie indígena do Chile e não estava na água chilena há meio século. O governo chileno na época visava crescer a economia e criar empregos para áreas pobres, desenvolvendo um negócio desalmão 33. Com a intervenção do exterior para o lucro do capital, o Chile fez grande sucesso no desenvolvimento da aquicultura estilo caneta, e o número de salmões aumentou notavelmente nas últimas décadas31,32,33. Posteriormente, uma grande quantidade de alimentos para salmão foi lançada no mar, levando as pessoas locais a suspeitar que a aquicultura de salmão é a razão para as frequentes HABs locais31,32. A verdade é desconhecida agora, mas deve ser entendida eventualmente para que estratégias para proteger o ambiente marinho local, a economia e a saúde humana dos HABs possam ser elaboradas. A análise molecular sobre a relação alga-bacteriana local pode contribuir para um esclarecimento avançado para tal assunto. Por exemplo, a técnica pode pesquisar as espécies algas e bacterianas que não estavam presentes na área oceânica alvo antes, mas aumentaram dramaticamente nos últimos anos, o que é um pouco semelhante ao estudo feito por Sakai et al. para a descoberta de uma população não registrada de salamandra Yamato (Hynobius vandenburghi) pelo SIG e análise eDNA34. Portanto, além da ferramenta de monitoramento hab, este protocolo de metabarificação tem o potencial de uso para outras perspectivas.
The authors have nothing to disclose.
Este estudo foi apoiado pela bolsa (JPMJSA1705) para um estudo sobre Parceria de Pesquisa em Ciência e Tecnologia para Algas de Monitoramento do Desenvolvimento Sustentável no Chile (SATREPS-MACH). Agradecemos à Dra. Agradecemos a Neal Andrew Holland por sua diligente revisão do manuscrito. Expressamos nosso sincero agradecimento aos membros do grupo de laboratório do CREAN-IFOP em Puerto Montt, Chile, por nos aconselharem sobre a identificação de fitoplâncton.
1.5 mL single tube | ThermoFisher | Q32856 | sterile |
1.5 mL tubes | ThermoFisher | 2150N | sterile |
8-strip 0.2 mL PCR tubes and flat cap | ThermoFisher | AB0451 & 4323032 | sterile |
96-well 0.2 mL PCR plate | ThermoFisher | N8010560 | |
AccuRuler 100 bp DNA Ladder | MaestroGen | 02001-500 | |
Chelex 100 Chelating Resin | Bio-Rad | 1432832 | |
Chemical Duty Vacuum Pressure Pump | MilliporeSigma | WP6122050 | |
D1000 Reagents | Agilent Technologies | 5067-5583 | |
D1000 sample buffer | Agilent Technologies | 5067-5602 | |
DNA loading dye (Blue/Orange Loading Dye 6X) | Promega | G1881 | |
Ethanol Molecular Biology Grade | E7023 | Merck KGaA | |
Filtration device | ThermoFisher | 09-740-36H, 09-740-23E | |
Fluorescent DNA concentration measurement kit (Qubit dsDNA HS Assay kit) | Thermo Fisher Scientific | Q32851 | |
Fluorometer (Qubit4 Fluorometer) | ThermoFisher | Q33238 | |
Fragment analysis verification matrix (D1000 ScreenTape) | Agilent Technologies | 5067-5582 | |
Fragment Analyzer (Agilent Tapestation 4150) | Agilent | G2992AA | |
GelRed Nucleic Acid Gel Stain | Biotium | 41002 | |
Generic bench vortexer (Vortex Genie 2) | Scientific Industries | SI-0236 | |
Heat block | |||
High performance sequencing-grade DNA polymerase (KAPA HiFi Hotstart ReadyMix), 2X | Roche | KK2602 | |
HT1 Hybridization buffer | Illumina | 20015892 | |
Illumina Nextera XT v2 Index Kit set A, B, C and D | Illumina | FC-131-2001, -2002, -2003, -2004 | |
Laminar hood cabinet | Biobase Co. | Biobase PCR-800 PCR Cabinet | |
Loading tips (Specific for Agilent TapeStation systems) | Agilent Technologies | 5067-5598 | |
Magnetic beads DNA cleanup system (ProNex® Size-Selective Purification System) | Promega | NG2002 | |
Magnetic stand for 96 wells (Magnetic Stand-96) | ThermoFisher | AM10027 | |
Micro-seal film for 96-well plate | ThermoFisher | 4311971 | sterile |
MiSeq Reagent Kit v3 | Illumina | MS-102-3003 | includes pre-filled, ready-to-use reagent cartridges. |
MiSeq system | Illumina | SY-410-1003 | includes pre-installed software |
Molecular grade nuclease-free water | Integrated DNA Technologies | 11-05-01-04 | |
Molecular grade sodium hydroxide (NaOH) 1M | Merck KGaA | 1091371000 | |
Multichannel pipettes | Not specified | Not specified | |
Multi-Purpose Agarose | Cleaver Scientific | CSL-AG500 | |
Ow D2 Wide-Gel Electrophoresis System | ThermoFisher | D2 | |
Ow EC-105 Compact Power Supply | ThermoFisher | 105ECA-115 | |
Pellet Pestle— Cordless Motor | ThermoFisher | K749540-0000 | |
PhiX control Kit v3 | Illumina | FC-110-300 | ready-to-use control library for Illumina sequencing |
Pipette tips | Not specified | Not specified | sterile |
Pipettes | Not specified | Not specified | 2, 10, 20, 100, 1000 μL |
SterivexTM GP 0.22 μm filter unit | MilliporeSigma | SVGP01050 | |
Tabletop centrifuge | Eppendorf 5427R Centrifuge | Eppendorf AG | |
TBE buffer | ThermoFisher | B52 | |
TE buffer (pH 8.0) | ThermoFisher | AM9849 | |
Terr PCR Direct FFPE Kit | Takara Bio USA | 639284 | includes 2X Terra PCR Direct Buffer |
Terra PCR Direct Polymerase Mix, 1.25 U/μL | Takara Bio USA | 639271 | High performance Inhibitor-tolerant DNA polymerase |
ThermalCycler (MiniAMP Plus Thermal Cycler) | ThermoFisher | A37835 | |
TransIlluminator and image capture system | Analytik Jena, AG | GelDoc-ItTS2 Imager | |
Whatman 1.0 m pore-sized membrane | MilliporeSigma | WHA111110 |