القياس الكمي بمساعدة البرمجيات لسمك العظام تحت الغضروف العظمي
Summary
تقدم مقالة المنهجية هذه بروتوكول قياس كمي بمساعدة البرمجيات لقياس سمك العظام تحت الغضروف النسيجي في مفاصل الركبة الفئرانية المصابة بالتهاب المفاصل العظمي الفئراني ومفاصل الركبة الطبيعية كضوابط. هذا البروتوكول حساس للغاية للسماكة الدقيقة وهو مناسب للكشف المبكر عن تغيرات العظام تحت الغضروف العظمية المبكرة.
Abstract
سماكة العظام تحت الغضروف والتصلب هي السمات المميزة الرئيسية لهشاشة العظام (OA) ، سواء في النماذج الحيوانية أو في البشر. حاليا ، يتم تحديد شدة سماكة العظام تحت الغضروف النسيجي في الغالب من خلال أنظمة التصنيف شبه الكمي القائمة على التقدير البصري. تقدم هذه المقالة بروتوكولا قابلا للتكرار وسهل التنفيذ لقياس سمك العظام تحت الغضروف الكمي كميا في نموذج فأر من OA الركبة الناجم عن زعزعة استقرار الغضروف المفصلي الإنسي (DMM). استخدم هذا البروتوكول برنامج ImageJ لقياس سمك العظام تحت الغضروف على الصور النسيجية بعد تحديد منطقة ذات أهمية في اللقمة الفخذية الإنسية وهضبة الظنبوب الطبية حيث يحدث سماكة العظام تحت الغضروف عادة في OA الركبة الناجم عن DMM. تم استخدام الصور النسيجية من مفاصل الركبة مع إجراء صوري كضوابط. وأشار التحليل الإحصائي إلى أن نظام قياس العظام الكمي تحت الغضروف الذي تم تطويره حديثا كان قابلا للتكرار بدرجة كبيرة مع وجود اختلافات منخفضة داخل المراقبين وفيما بينهم. تشير النتائج إلى أن البروتوكول الجديد أكثر حساسية لسماكة العظام تحت الغضروف الدقيقة أو الخفيفة من أنظمة التصنيف البصري المستخدمة على نطاق واسع. هذا البروتوكول مناسب للكشف عن كل من التغيرات المبكرة والمتقدمة في العظام تحت الغضروف ولتقييم فعالية علاجات OA في الجسم الحي بالتنسيق مع تصنيف غضروف OA.
Introduction
هشاشة العظام (OA) ، التي تتميز شعاعيا بتضييق مساحة المفاصل بسبب فقدان الغضروف المفصلي ، والخلايا العظمية ، وتصلب العظام تحت الغضروف (SCB) ، هي الشكل الأكثر شيوعا لالتهاب المفاصل 1,2. على الرغم من أن دور العظام المحيطة بالمفصل في مسببات OA غير مفهوم تماما ، إلا أن تكوين الخلايا العظمية والتصلب SCB يعتقد عموما أنهما نتائج لعملية المرض وليس العوامل المسببة ، ولكن التغييرات في بنية / شكل العظام حول المفصل والبيولوجيا قد تسهم في تطور وتطور OA3,4 . يعد تطوير نظام دقيق وسهل التنفيذ لتصنيف الزراعة العضوية ، بما في ذلك قياس SCB ، أمرا بالغ الأهمية للدراسات المقارنة بين مختبرات الأبحاث وفي تقييم فعالية العوامل العلاجية المصممة لمنع أو تخفيف تطور OA.
تم بناء SCB مع صفيحة عظمية رقيقة تشبه القبة وطبقة أساسية من العظام التربيقية. صفيحة SCB هي الصفيحة القشرية ، التي تقع بالتوازي مع الغضروف المتكلس وتحته مباشرة. تخترق الفروع الصغيرة من الأوعية الشريانية والوريدية ، وكذلك الأعصاب ، القنوات الموجودة في صفيحة SCB ، وتتواصل بين الغضروف المتكلس والعظم التربيقي. يحتوي العظم التربيقي تحت الغضروف على أوعية دموية وأعصاب حسية ونخاع عظمي وهو أكثر مسامية ونشاطا استقلابيا من لوحة SCB. لذلك ، يمارس SCB وظائف امتصاص الصدمات والداعمة وهو مهم أيضا لإمدادات المغذيات الغضروفية والتمثيل الغذائي في المفاصل الطبيعية5،6،7،8.
سماكة SCB (في علم الأنسجة) والتصلب (في التصوير الشعاعي) هي السمات المميزة الرئيسية للزراعة العضوية ومجالات البحث الرئيسية في الفيزيولوجيا المرضية OA. يعد قياس سماكة SCB مكونا مهما في التقييمات النسيجية لشدة OA. وقد أدى التصوير الشعاعي المجهري الرقمي الذي تم الإبلاغ عنه سابقا لقياس الكثافة المعدنية للقوارض SCB9 وكذلك التصوير المقطعي المحوسب الدقيق (micro-CT) القائم على قياس SCB الكمي في نماذج القوارض من OA10,11,12,13 إلى تحسين فهمنا لبنية SCB ودور تغيرات SCB في الفيزيولوجيا المرضية ل OA. كما تم تحديد مساحة SCB وسمكها كميا باستخدام شرائح نسيجية باستخدام نظام كمبيوتر متطور مع برنامج محدد ومكلف لقياس الأنسجة العظمية14. ومع ذلك، فإن أنظمة تصنيف النفاذ المفتوح شبه الكمي القائمة على التقدير البصري، بما في ذلك تصنيف سماكة SCB، تستخدم على نطاق أوسع من التصوير المقطعي المحوسب الجزئي في الوقت الحالي لأن أنظمة الدرجات سهلة الاستخدام، خاصة لفحص العديد من الصور النسيجية. ومع ذلك ، فإن معظم أنظمة تصنيف OA الحالية تركز بشكل أساسي على تغيرات الغضاريف15،16،17. طريقة تصنيف سمك SCB العظمية المستخدمة على نطاق واسع والتي تصنف سماكة SCB على أنها خفيفة ومعتدلة وشديدة هي طريقة ذاتية إلى حد كبير ، ولم يتم التحقق من موثوقيتها بالكامل15. بروتوكول قياس سمك SCB الموثوق به وسهل التنفيذ خطوة بخطوة إما غير مطور بالكامل أو غير موحد.
هدفت هذه الدراسة إلى تطوير بروتوكول قابل للتكرار وحساس وسهل التنفيذ لقياس سمك SCB كميا في نموذج الماوس من الزراعة العضوية (OA). أظهرت اختبارات القياس الصارمة والتحليل الإحصائي أن بروتوكول القياس الكمي المدعوم ببرنامج ImageJ هذا يمكن أن يحدد سمك SCB في كل من مفاصل الركبة العادية والتهاب المفاصل العظمي. البروتوكول الذي تم تطويره حديثا قابل للتكرار وأكثر حساسية لتغيرات SCB الخفيفة من أنظمة التصنيف المرئي المستخدمة على نطاق واسع. يمكن استخدامه للكشف المبكر عن تغيرات SCB العظمية المفصلية وتقييم فعالية علاجات OA في الجسم الحي بالتنسيق مع تصنيف غضروف OA.
Protocol
Representative Results
Discussion
يعد قياس سماكة SCB مكونا مهما في التقييمات النسيجية لشدة OA. تركز معظم أنظمة تصنيف OA الحالية بشكل أساسي على تغيرات الغضاريف15،16،17. طريقة تصنيف سمك SCB العظمية الفئرانية المستخدمة على نطاق واسع والتي تصنف سماكة SCB على أنها خفيفة ومعتدلة وشديدة …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم هذا العمل من قبل المعهد الوطني لالتهاب المفاصل والأمراض العضلية الهيكلية والجلدية التابعة للمعاهد الوطنية للصحة (NIH) تحت رقم الجائزة R01 AR059088 ، ووزارة الدفاع (DoD) تحت رقم جائزة البحث W81XWH-12-1-0304 ، ومنحة ماري وبول هارينغتون للأستاذية المتميزة.
Materials
| Safranin-O | Sigma-Aldrich | S8884 | |
| Fast green | Sigma-Aldrich | F7252 | |
| Hematoxylin | Sigma-Aldrich | GHS216 | |
| Eosin | Sigma-Aldrich | E4382 | |
| illustrator | Adobe | Not applicable |
References
- Kotlarz, H., Gunnarsson, C. L., Fang, H., Rizzo, J. A. Insurer and out-of-pocket costs of osteoarthritis in the US: evidence from national survey data. Arthritis and Rheumatology. 60 (12), 3546-3553 (2009).
- Buckwalter, J. A., Martin, J. A. Osteoarthritis. Advanced Drug Delivery Reviews. 58 (2), 150-167 (2006).
- Weinans, H., et al. Pathophysiology of peri-articular bone changes in osteoarthritis. Bone. 51 (2), 190-196 (2012).
- Baker-LePain, J. C., Lane, N. E. Role of bone architecture and anatomy in osteoarthritis. Bone. 51 (2), 197-203 (2012).
- Li, G., et al. Subchondral bone in osteoarthritis: Insight into risk factors and microstructural changes. Arthritis Research and Therapy. 15 (6), 223 (2013).
- Madry, H., van Dijk, C. N., Mueller-Gerbl, M. The basic science of the subchondral bone. Knee Surgery, Sports, Traumatology, Arthrosclerosis. 18 (4), 419-433 (2010).
- Milz, S., Putz, R. Quantitative morphology of the subchondral plate of the tibial plateau. Journal of Anatomy. 185, 103-110 (1994).
- Blalock, D., Miller, A., Tilley, M., Wang, J. Joint instability and osteoarthritis. Clinical Medicine Insights: Arthritis and Musculoskeleton Disorders. 8, 15-23 (2015).
- Waung, J. A., et al. Quantitative X-ray microradiography for high-throughput phenotyping of osteoarthritis in mice. Osteoarthritis Cartilage. 22 (10), 1396-1400 (2014).
- Botter, S. M., et al. Cartilage damage pattern in relation to subchondral plate thickness in a collagenase-induced model of osteoarthritis. Osteoarthritis Cartilage. 16 (4), 506-514 (2008).
- Nalesso, G., et al. Calcium calmodulin kinase II activity is required for cartilage homeostasis in osteoarthritis. Science Reports. 11 (1), 5682 (2021).
- Ding, M., Christian Danielsen, C., Hvid, I. Effects of hyaluronan on three-dimensional microarchitecture of subchondral bone tissues in guinea pig primary osteoarthrosis. Bone. 36 (3), 489-501 (2005).
- Kraus, V. B., Huebner, J. L., DeGroot, J., Bendele, A. The OARSI histopathology initiative – recommendations for histological assessments of osteoarthritis in the guinea pig. Osteoarthritis Cartilage. 18, 35-52 (2010).
- McNulty, M. A., et al. A comprehensive histological assessment of osteoarthritis lesions in Mice. Cartilage. 2 (4), 354-363 (2011).
- Glasson, S. S., Chambers, M. G., Van Den Berg, W. B., Little, C. B. The OARSI histopathology initiative – recommendations for histological assessments of osteoarthritis in the mouse. Osteoarthritis Cartilage. 18, 17-23 (2010).
- Pritzker, K. P., et al. Osteoarthritis cartilage histopathology: grading and staging. Osteoarthritis Cartilage. 14 (1), 13-29 (2006).
- Mankin, H. J., Dorfman, H., Lippiello, L., Zarins, A. Biochemical and metabolic abnormalities in articular cartilage from osteo-arthritic human hips. II. Correlation of morphology with biochemical and metabolic data. Journal of Bone and Joint Surgery American. 53 (3), 523-537 (1971).
- Glasson, S. S., Blanchet, T. J., Morris, E. A. The surgical destabilization of the medial meniscus (DMM) model of osteoarthritis in the 129/SvEv mouse. Osteoarthritis Cartilage. 15 (9), 1061-1069 (2007).
- Wang, J., et al. Transcription factor Nfat1 deficiency causes osteoarthritis through dysfunction of adult articular chondrocytes. Journal of Pathology. 219 (2), 163-172 (2009).
- Zhang, M., Lu, Q., Budden, T., Wang, J. NFAT1 protects articular cartilage against osteoarthritic degradation by directly regulating transcription of specific anabolic and catabolic genes. Bone Joint Research. 8 (2), 90-100 (2019).
- Zhang, M., et al. Epigenetically mediated spontaneous reduction of NFAT1 expression causes imbalanced metabolic activities of articular chondrocytes in aged mice. Osteoarthritis Cartilage. 24 (7), 1274-1283 (2016).
- Rodova, M., et al. Nfat1 regulates adult articular chondrocyte function through its age-dependent expression mediated by epigenetic histone methylation. Journal of Bone and Mineral Research. 26 (8), 1974-1986 (2011).
- Jackson, M. T., et al. Depletion of protease-activated receptor 2 but not protease-activated receptor 1 may confer protection against osteoarthritis in mice through extracartilaginous mechanisms. Arthritis and Rheumatology. 66 (12), 3337-3348 (2014).
