Um sistema de explant para estudos de imagem de lapso de tempo da montagem do circuito olfativo em Drosophila

Summary

Este protocolo descreve o procedimento de dissecção, condição cultural e imagem ao vivo de um sistema de explant antena-cérebro para o estudo do conjunto do circuito olfativo.

Abstract

~Os neurônios são precisamente interconectados para formar circuitos essenciais para a função adequada do cérebro. O sistema olfativo Drosophila fornece um excelente modelo para investigar esse processo, uma vez que 50 tipos de neurônios receptores olfativos (ORNs) das antenas e palpas maxilares projetam seus axônios a 50 glomeruli identificáveis no lobo antena e formam conexões sinápticas com dendritos de 50 tipos de neurônios de projeção de segunda ordem (PNs). Estudos anteriores se concentraram principalmente na identificação de moléculas importantes que regulam o direcionamento preciso no circuito olfativo usando tecidos fixos. Aqui, um sistema de explant antennae-cérebro que recapitula os principais marcos de desenvolvimento da montagem do circuito olfativo na cultura é descrito. Através da dissecação da cutícula externa e limpeza de corpos de gordura opacos que cobrem o cérebro pupal em desenvolvimento, imagens de alta qualidade de neurônios únicos de cérebros vivos podem ser coletadas usando microscopia de dois fótons. Isso permite imagens de lapso de tempo de um único axônio ORN direcionado a partir de tecido vivo. Essa abordagem ajudará a revelar importantes contextos biológicos celulares e funções de genes importantes previamente identificados e identificar mecanismos que sustentam o processo dinâmico de montagem do circuito.

Introduction

Os neurônios são precisamente interligados para formar circuitos essenciais para a função adequada do cérebro. Por mais de 100 anos, os neurocientistas têm tentado entender como os neuritos se estendem em direção aos seus alvos intermediários e finais com extrema precisão. Como resultado, eles identificaram genes importantes que codificam pistas de orientação para o desenvolvimento de processos neuronais¹. O sistema olfativo Drosophila fornece um excelente modelo para investigar esse processo desde os neurônios receptores olfativos (ORNs, os neurônios sensoriais primários) projetam-se para 50 glomeruli identificáveis com tamanho estereotipado, forma e posição relativa, onde formam conexões sinápticas com dendritos de 50 tipos de neurônios de projeção de segunda ordem (PNs), cada um dos quais envia dendritos para um dos 50 glomeruli² (Figura 1A ). Portanto, é relativamente fácil identificar fenótipos mutantes na resolução sináptica (glomerular) no sistema olfativo de mosca. Isso levou a descobertas de genes importantes que regulam o conjunto do circuito olfativo³.

A montagem do circuito olfativo da mosca conta com processos de desenvolvimento temporal e^{espacialmente} coordenados 3. ORNs e PNs adquirem destinos celulares distintos, que configuram o programa para suas especificidades de fiação. Em seguida, dendritos PN pré-padrão do lóbulo antena (Figura 1B). Os axônios de ORNs então circunavegam o lobo antena ipsilateral e cruzam a linha média do cérebro para alcançar o lobo antena contralateral. Posteriormente, os axônios ORN invadem os lobos ipsi e contralateral das antenas e formam sinapses com dendritos de seus PNs parceiros em glomeruli específico. Este modelo grosseiro para montagem de circuito olfativo foi proposto com base na caracterização de amostras fixas a partir de pontos de tempo intermediários durante o desenvolvimento. A baixa resolução temporal e a incapacidade de seguir os mesmos processos neuronais através do desenvolvimento do tecido fixo limitam a compreensão mecanicista do processo de montagem do circuito.

É tecnicamente desafiador viver os processos orn e PN in vivo, uma vez que o processo de fiação ocorre na primeira metade da fase pupal quando o lobo antena é cercado por corpo de gordura opaco dentro da caixa pupal. É, portanto, impossível imaginar diretamente o circuito olfativo em desenvolvimento a partir de pupas intactas. Tecidos dissecados cultivados ex vivo podem contornar a opacidade tecidual e têm sido usados com sucesso para estudar o desenvolvimento neural ^4,5,6. O desafio de usar uma estratégia de cultura ex vivo ex vivo semelhante para estudar a fiação neuronal no cérebro pupal é se ele recapitula o neurônio preciso direcionado em uma condição cultural. Com base em uma condição de cultura ex vivo relatada anteriormente para o complexo olho-cérebro⁷, uma explanta que contém todo o cérebro pupal, antenas e os nervos antenas de conexão intactos foi recentemente desenvolvido, que retém alvo preciso do circuito olfativo e pode ser submetido a imagens ao vivo baseadas em microscopia de dois fótons por até 24 h na frequência de cada 20 min⁸ . Aqui, um protocolo detalhado da cultura explant e imagem é descrito. O sistema de explant fornece um método poderoso para estudar a montagem de circuito olfativo e, potencialmente, outros circuitos no cérebro central.

Protocol

1. Preparação de reagentes NOTA: Todas as etapas deste protocolo são realizadas à temperatura ambiente (20-25 °C) a menos que explique o contrário. Para preparar a placa de cultura para imobilizar a explantização durante a imagem do lapso de tempo, coloque Sylgard de 0,5 cm de espessura (misture completamente dois componentes líquidos na proporção 10:1 antes do uso) na superfície inferior de uma placa de Petri de 60 mm x 15 mm e deixe curar por 48 h à te…

Representative Results

Os axônios ORN chegam ao lóbulo das antenas entre 18h e 36 h APF. Eles então navegam pelo lóbulo da antena, cruzam a linha média e inervam o glomeruli. Vídeo 1 é um vídeo representativo mostrando todo o processo para vários axônios individualmente identificáveis, tirados na frequência de cada 20 min por 24 h. Antes do registro usando o TurboReg, os axônios exibem alguns desvios laterais à medida que o cérebro se desenvolve (primeira metade do vídeo). Após o registro, a deriva é corrigid…

Discussion

A explanta drosophila antennae-cérebro mantém o alvo normal do circuito olfativo. Notamos que o desenvolvimento é 2 vezes mais lento em relação ao in vivo. Nota-se que o sistema de explant não retém palp maxilar, que hospeda seis tipos de ORNs. Para garantir que o desenvolvimento normal seja recapitulado ex vivo, o alongamento dos nervos antenas precisa ser evitado durante a dissecação da explant. Durante a cultura ex vivo , o crescimento das bactérias geralmente cau…

Materials

20-hydroxyecdysone	Sigma	H5142
Chameleon Ti:Sapphire laser	Coherent	Coherent MRU X1
Fetal Bovine Serum	Thermo Fisher Scientific	10082147
Human insulin	Thermo Fisher Scientific	12585014
Imaging software	Prairie
Micro Scissors	World Precision Instruments	501778
Minutien Pins	Fine Science Tools	26002-10
Oxygen cylinder	Praxair	OX M-E
Penicillin-Streptomycin	Thermo Fisher Scientific	15140122
Schneider’s Drosophila Medium	Thermo Fisher Scientific	21720024
SYLGARD 184 Silicone Elastomer	Thermo Fisher Scientific	NC0162601
Two-photon microscopy	Bruker
water immerse objective (20X)	Zeiss	421452-9800-000