تحليل التدفق الخلوي لتحديد الخلايا المناعية الفطرية والتكيفية للرئة الفخذية
Summary
في هذه الدراسة ، نقدم بروتوكولا فعالا وقابلا للتكرار لعزل السكان المناعيين للجهاز التنفسي الفئراني. كما نقدم طريقة لتحديد جميع الخلايا المناعية الفطرية والتكيفية التي توجد في رئتي الفئران السليمة ، باستخدام لوحة قياس التدفق الخلوي القائمة على 9 ألوان.
Abstract
الجهاز التنفسي على اتصال مباشر مع البيئة الخارجية ويتطلب نظام مناعي منظم بدقة لتوفير الحماية مع قمع ردود الفعل غير المرغوب فيها على المستضدات البيئية. تستضيف الرئتين عدة مجموعات من الخلايا المناعية الفطرية والتكيفية التي توفر المراقبة المناعية ولكنها تتوسط أيضا في الاستجابات المناعية الوقائية. هذه الخلايا ، التي تحافظ على توازن الجهاز المناعي الرئوي الصحي ، تشارك أيضا في العديد من الحالات المرضية مثل الربو والالتهابات وأمراض المناعة الذاتية والسرطان. يوفر التعبير الانتقائي للبروتينات السطحية وداخل الخلايا خصائص مناعية فريدة للخلايا المناعية في الرئة. وبالتالي ، فإن قياس التدفق الخلوي له دور أساسي في تحديد مجموعات الخلايا هذه خلال الحالة الثابتة والظروف المرضية. تقدم هذه الورقة بروتوكولا يصف طريقة متسقة وقابلة للتكرار لتحديد الخلايا المناعية الموجودة في رئتي الفئران السليمة في ظل ظروف الحالة الثابتة. ومع ذلك ، يمكن أيضا استخدام هذا البروتوكول لتحديد التغيرات في مجموعات الخلايا هذه في نماذج الأمراض المختلفة للمساعدة في تحديد التغيرات الخاصة بالمرض في المشهد المناعي للرئة.
Introduction
يحتوي الجهاز التنفسي الفئراني على نظام مناعي فريد مسؤول عن مكافحة مسببات الأمراض والحفاظ على التوازن المناعي. يتكون الجهاز المناعي الرئوي من مجموعات خلوية ذات تباين كبير في نمطها الظاهري ووظيفتها وأصلها وموقعها. توجد البلاعم السنخية المقيمة (AMs) ، التي نشأت بشكل رئيسي من الخلايا الوحيدة الجنينية ، في التجويف السنخي1 ، في حين أن البلاعم الخلالية المشتقة من نخاع العظام (IMs) موجودة في حمة الرئة 2. ويمكن كذلك تصنيف الرسائل الفورية تصنيفا فرعيا من خلال التعبير عن CD206. تملأ CD206+ IMs المنطقة المحيطة بالشعب الهوائية وحول الأوعية الدموية ، بينما تقع CD206– IMs في الخلالي السنخي 3. تم اقتراح بعض التصنيفات الفرعية للرسائل الفورية مؤخرا3،4،5،6. على الرغم من أن IMs أقل دراسة من AMs ، إلا أن الأدلة الحديثة تدعم دورها الحاسم في تنظيم الجهاز المناعي للرئة 7. بالإضافة إلى ذلك ، يتم التعبير عن CD206 أيضا في AMs8 المنشطة بدلا من ذلك.
الخلايا المتغصنة الرئوية (DCs) هي مجموعة أخرى غير متجانسة من الخلايا المناعية الرئوية فيما يتعلق بخصائصها الوظيفية وموقعها وأصلها. تم وصف أربع فئات فرعية من DCs في الرئة: DCs التقليدية CD103 + (المعروفة أيضا باسم cDC1) ، CD11b + DCs التقليدية (المعروفة أيضا باسم cDC2) ، DCs المشتقة من الخلايا الأحادية (MoDCs) ، و DCs9,10,11,12,13. يمكن تعريف الفئات الفرعية الثلاث الأولى على أنها مجمع التوافق النسيجي الرئيسي (MHC) II + CD11c + 9،10،14،15. تعبر DCs البلازما عن MHC II وهي إيجابية بشكل متوسط ل CD11c ولكنها تعبر عن مستويات عالية من B220 و PDCA-19,13,16. في رئتي الفئران الساذجتين ، توجد CD103 DCs و CD11b DCs في الممر الخلالي للمجرى الهوائي ، في حين توجد DCs البلازما في الخلالي السنخي 17.
توجد مجموعتان رئيسيتان من الخلايا الوحيدة في الرئة أثناء الحالة المستقرة: الخلايا الوحيدة الكلاسيكية والخلايا الوحيدة غير الكلاسيكية. الخلايا الوحيدة الكلاسيكية هي Ly6C + وهي حاسمة للاستجابة الالتهابية الأولية. في المقابل ، فإن الخلايا الوحيدة غير الكلاسيكية هي Ly6C – وقد تم النظر إليها على نطاق واسع على أنها خلايا مضادة للالتهابات 3،16،18. في الآونة الأخيرة ، تم وصف مجموعة إضافية من الخلايا الوحيدة CD64 + CD16.2 + ، والتي تنشأ من الخلايا الوحيدة Ly6C وتؤدي إلى CD206 + IMs3.
تظهر الحمضات بشكل رئيسي في الرئتين أثناء عدوى الديدان الطفيلية أو حالات الحساسية. ومع ذلك ، هناك عدد قليل من الحمضات في الحمة الرئوية خلال الحالة المستقرة ، والمعروفة باسم الحمضات المقيمة. على النقيض من الحمضات المقيمة ، توجد الحمضات الالتهابية في الخلالي الرئوي وغسل القصبات السنخية (BAL). في نماذج الفئران من عث غبار المنزل (HDM) ، يتم تجنيد الحمضات الالتهابية في الرئة بعد التحفيز بوساطة المستضد. وقد اقترح أن الحمضات المقيمة قد يكون لها دور تنظيمي في الحساسية عن طريق تثبيط حساسية T helper 2 (Th2) ل HDM19.
على النقيض من بقية الخلايا النخاعية الرئوية ، تعبر العدلات عن Ly6G ولكن ليس CD68 وتتميز بتوقيع النمط الظاهري المناعي CD68-Ly6G + 16,20,21. أظهرت دراسات التصور أنه خلال الحالة المستقرة، تحتفظ الرئة بمجموعة من العدلات في المقصورة داخل الأوعية الدموية وتستضيف عددا كبيرا من العدلات خارج الأوعية الدموية22. على غرار الحمضات ، لا توجد العدلات في BAL في حالة ثابتة. ومع ذلك ، فإن العديد من أشكال التحفيز المناعي ، مثل تحدي LPS أو الربو أو الالتهاب الرئوي ، تدفع العدلات إلى التجويف السنخي ، مما يؤدي إلى وجودها في BAL21،22،23.
يمثل عدد كبير من خلايا CD45+ في الرئة القاتل الطبيعي (NK) والخلايا التائية والخلايا البائية وهي سلبية لمعظم علامات النخاع الشوكي24. في رئتي الفئران الساذجة ، يمكن تحديد هذه الأنواع الثلاثة من الخلايا بناء على تعبير CD11b و MHC II18. حوالي 25٪ من خلايا CD45+ الرئوية هي خلايا بائية ، في حين أن النسبة المئوية لخلايا NK أعلى في الرئة من الأنسجة اللمفاوية وغير اللمفاوية الأخرى24،25،26. بين الخلايا التائية الرئوية ، جزء كبير هو CD4-CD8– ويلعب دورا مهما في التهابات الجهاز التنفسي26.
نظرا لأن الرئة تستضيف جهازا مناعيا معقدا وفريدا للغاية ، فقد تم تطوير العديد من استراتيجيات البوابة لتحديد الخلايا المناعية الرئوية والإبلاغ عنها16،18،20،27. توفر استراتيجية البوابات الموضحة هنا طريقة شاملة وقابلة للتكرار لتحديد ما يصل إلى 12 مجموعة مناعية نخاعية رئوية وغير نخاعية مختلفة باستخدام 9 علامات. تم استخدام علامات إضافية للتحقق من صحة النتائج. علاوة على ذلك ، يتم توفير طريقة مفصلة لإعداد تعليق أحادي الخلية يقلل من موت الخلايا ويسمح بتحديد المظهر الأكثر اكتمالا لحجرة الخلايا المناعية في الرئة. تجدر الإشارة إلى أن تحديد الخلايا غير المناعية في الرئة ، مثل الخلايا الظهارية (CD45-CD326 + CD31-) ، والخلايا البطانية (CD45-CD326-CD31 +) ، والخلايا الليفية يتطلب نهجا مختلفا28,29. ولا يشمل البروتوكول والطريقة الموصوفة هنا تحديد هوية هؤلاء السكان.
Protocol
Representative Results
Discussion
يمكن أن يكون تحديد الخلايا المناعية الرئوية أمرا صعبا بسبب أنواع الخلايا المناعية المتعددة الموجودة في الرئة وخصائصها المناعية الفريدة مقارنة بنظيراتها المقيمة في الأنسجة الأخرى. في العديد من الحالات المرضية ، تظهر الخلايا ذات السمات الظاهرية المميزة في الرئتين. على سبيل المثال ، تؤدي ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم هذا العمل من خلال منح المعاهد الوطنية للصحة R01CA238263 و R01CA229784 (VAB).
Materials
| 10 mL syringe plunger | EXELINT | 26265 | |
| 18 G needles | BD Precision Glide Needle | 305165 | |
| 21 G needles | BD Precision Glide Needle | 305195 | |
| 50 mL conical tubes | Falcon | 3520 | |
| 70 μm cell strainer | ThermoFisher | 22363548 | |
| 96-well plates | Falcon/corning | 3799 | |
| ACK Lysing Buffer | ThermoFisher | A10492-01 | |
| anti-mouse CD11b | Biolegend | 101215 | For details see Table 2 |
| anti-mouse CD11c | Biolegend | 117339 / 117337 | For details see Table 2 |
| anti-mouse CD45 | Biolegend | 103115 | For details see Table 2 |
| anti-mouse CD64 | Biolegend | 139319 | For details see Table 2 |
| anti-mouse CD68 | Biolegend | 137009 | For details see Table 2 |
| anti-mouse GR-1 | Biolegend | 108433 | For details see Table 2 |
| anti-mouse Siglec F | Biolegend | 155503 | For details see Table 2 |
| AVERTIN | Sigma-Aldrich | 240486 | |
| B220 | Biolegend | 103228 | For details see Table 2 |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | 9048-46-8 | |
| CD103 | Biolegend | 121405 / 121419 | For details see Table 2 |
| CD24 | Biolegend | 138503 | For details see Table 2 |
| CD3 | Biolegend | 100205 | For details see Table 2 |
| Centrifuge | |||
| Collagenase Type 1 | Worthington Biochemical Corp | LS004196 | |
| CX3CR1 | Biolegend | 149005 | For details see Table 2 |
| DNase I | Millipore Sigma | 10104159001 | |
| Ethanol | |||
| F4/80 | Biolegend | 123133 | For details see Table 2 |
| FcBlock (CD16/32) | Biolegend | 101301 | For details see Table 2 |
| Fetal Bovine Serum | R&D Systems | ||
| Fine Serrated Forceps | Roboz Surgical Instrument Co | ||
| Foxp3 / Transcription Factor Staining Buffer Set | ThermoFisher | 00-5523-00 | |
| Futura Safety Scalpel | Merit Medical Systems | SMS210 | |
| Live/Dead Fixable Far Read Dead Cell Stain Kit | ThermoFisher | L34973 | For details see Table 2 |
| MERTK | Biolegend | 151505 | For details see Table 2 |
| MHC-II | Biolegend | 107621 | For details see Table 2 |
| NK1.1 | Biolegend | 108705 | For details see Table 2 |
| Orbital Shaker | VWR | Model 200 | |
| Petri dish | Falcon | 351029 | |
| Refrigerated benchtop centrifuge | SORVAL ST 16R | ||
| Small curved scissor | Roboz Surgical Instrument Co |
References
- Guilliams, M., et al. Alveolar macrophages develop from fetal monocytes that differentiate into long-lived cells in the first week of life via GM-CSF. Journal of Experimental Medicine. 210 (10), 1977-1992 (2013).
- Tan, S. Y., Krasnow, M. A. Developmental origin of lung macrophage diversity. Development. 143 (8), 1318-1327 (2016).
- Schyns, J., et al. Non-classical tissue monocytes and two functionally distinct populations of interstitial macrophages populate the mouse lung. Nature Communications. 10 (1), 3964 (2019).
- Gibbings, S. L., et al. Three unique interstitial macrophages in the murine lung at steady state. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 57 (1), 66-76 (2017).
- Ural, B. B., et al. Identification of a nerve-associated, lung-resident interstitial macrophage subset with distinct localization and immunoregulatory properties. Science Immunology. 5 (45), 8756 (2020).
- Chakarov, S., et al. Two distinct interstitial macrophage populations coexist across tissues in specific subtissular niches. Science. 363 (6432), (2019).
- Liegeois, M., Legrand, C., Desmet, C. J., Marichal, T., Bureau, F. The interstitial macrophage: A long-neglected piece in the puzzle of lung immunity. Cellular Immunology. 330, 91-96 (2018).
- Stouch, A. N., et al. IkappaB kinase activity drives fetal lung macrophage maturation along a non-M1/M2 paradigm. Journal of Immunology. 193 (3), 1184-1193 (2014).
- Kopf, M., Schneider, C., Nobs, S. P. The development and function of lung-resident macrophages and dendritic cells. Nature Immunology. 16 (1), 36-44 (2015).
- Plantinga, M., et al. Conventional and monocyte-derived CD11b(+) dendritic cells initiate and maintain T helper 2 cell-mediated immunity to house dust mite allergen. Immunity. 38 (2), 322-335 (2013).
- Liu, H., et al. Dendritic cell trafficking and function in rare lung diseases. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 57 (4), 393-402 (2017).
- Cook, P. C., MacDonald, A. S. Dendritic cells in lung immunopathology. Seminars in Immunopathology. 38, 449-460 (2016).
- Guilliams, M., Lambrecht, B. N., Hammad, H. Division of labor between lung dendritic cells and macrophages in the defense against pulmonary infections. Mucosal Immunology. 6 (3), 464-473 (2013).
- Nobs, S. P., et al. PPARγ in dendritic cells and T cells drives pathogenic type-2 effector responses in lung inflammation. Journal of Experimental Medicine. 214 (10), 3015-3035 (2017).
- Aegerter, H., et al. Influenza-induced monocyte-derived alveolar macrophages confer prolonged antibacterial protection. Nature Immunology. 21 (2), 145-157 (2020).
- Misharin, A. V., Morales-Nebreda, L., Mutlu, G. M., Budinger, G. R., Perlman, H. Flow cytometric analysis of macrophages and dendritic cell subsets in the mouse lung. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 49 (4), 503-510 (2013).
- Hoffmann, F. M., et al. Distribution and interaction of murine pulmonary phagocytes in the naive and allergic lung. Frontiers in Immunology. 9, 1046 (2018).
- Yu, Y. R., et al. A protocol for the comprehensive flow cytometric analysis of immune cells in normal and inflamed murine non-lymphoid tissues. PLoS One. 11 (3), 0150606 (2016).
- Mesnil, C., et al. Lung-resident eosinophils represent a distinct regulatory eosinophil subset. Journal of Clinical Investigation. 126 (9), 3279-3295 (2016).
- Zaynagetdinov, R., et al. Identification of myeloid cell subsets in murine lungs using flow cytometry. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 49 (2), 180-189 (2013).
- Tavares, A. H., Colby, J. K., Levy, B. D., Abdulnour, R. E. A model of self-limited acute lung injury by unilateral intra-bronchial acid instillation. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (150), e60024 (2019).
- Kreisel, D., et al. In vivo two-photon imaging reveals monocyte-dependent neutrophil extravasation during pulmonary inflammation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (42), 18073-18078 (2010).
- Krishnamoorthy, N., et al. Neutrophil cytoplasts induce TH17 differentiation and skew inflammation toward neutrophilia in severe asthma. Science Immunology. 3 (26), (2018).
- Ascon, D. B., et al. Normal mouse kidneys contain activated and CD3+CD4- CD8- double-negative T lymphocytes with a distinct TCR repertoire. Journal of Leukocyte Biology. 84 (6), 1400-1409 (2008).
- Wang, J., et al. Lung natural killer cells in mice: phenotype and response to respiratory infection. Immunology. 137 (1), 37-47 (2012).
- Cowley, S. C., Meierovics, A. I., Frelinger, J. A., Iwakura, Y., Elkins, K. L. Lung CD4-CD8- double-negative T cells are prominent producers of IL-17A and IFN-gamma during primary respiratory murine infection with Francisella tularensis live vaccine strain. Journal of Immunology. 184 (10), 5791-5801 (2010).
- Gibbings, S. L., Jakubzick, C. V., Alper, S., Janssen, W. Isolation and characterization of mononuclear phagocytes in the mouse lung and lymph nodes. In Lung innate immunity and inflammation. Methods in Molecular Biology. 1809, (2018).
- Singer, B. D., et al. Flow-cytometric method for simultaneous analysis of mouse lung epithelial, endothelial, and hematopoietic lineage cells. American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 310 (9), 796-801 (2016).
- Matsushima, S., et al. CD248 and integrin alpha-8 are candidate markers for differentiating lung fibroblast subtypes. BMC Pulmonary Medicine. 20 (1), 21 (2020).
- Cong, J., Wei, H. Natural killer cells in the lungs. Frontiers in Immunology. 10, 1416 (2019).
- Daubeuf, F., et al. A fast, easy, and customizable eight-color flow cytometric method for analysis of the cellular content of bronchoalveolar lavage fluid in the mouse. Current Protocols in Mouse Biology. 7 (2), 88-99 (2017).
- Yi, S., et al. Eosinophil recruitment is dynamically regulated by interplay among lung dendritic cell subsets after allergen challenge. Nature Communications. 9 (1), 3879 (2018).
- Langlet, C., et al. CD64 expression distinguishes monocyte-derived and conventional dendritic cells and reveals their distinct role during intramuscular immunization. Journal of Immunology. 188 (4), 1751-1760 (2012).
- Moran, T. P., Nakano, H., Kondilis-Mangum, H. D., Wade, P. A., Cook, D. N. Epigenetic control of Ccr7 expression in distinct lineages of lung dendritic cells. Journal of Immunology. 193 (10), 4904-4913 (2014).
- Schyns, J., Bureau, F., Marichal, T. Lung interstitial macrophages: past, present, and future. Journal of Immunology Research. 2018, 5160794 (2018).
- Krljanac, B., et al. RELMalpha-expressing macrophages protect against fatal lung damage and reduce parasite burden during helminth infection. Science Immunology. 4 (35), (2019).
- Ginhoux, F., Guilliams, M. Tissue-resident macrophage ontogeny and homeostasis. Immunity. 44 (3), 439-449 (2016).
- Svedberg, F. R., et al. The lung environment controls alveolar macrophage metabolism and responsiveness in type 2 inflammation. Nature Immunology. 20 (5), 571-580 (2019).
- Yona, S., et al. Fate mapping reveals origins and dynamics of monocytes and tissue macrophages under homeostasis. Immunity. 38 (1), 79-91 (2013).
- Misharin, A. V., et al. Monocyte-derived alveolar macrophages drive lung fibrosis and persist in the lung over the life span. Journal of Experimental Medicine. 214 (8), 2387-2404 (2017).
- Koch, C. M., Chiu, S. F., Misharin, A. V., Ridge, K. M. Lung Interstitial Macrophages: Establishing Identity and Uncovering Heterogeneity. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 57 (1), 7-9 (2017).
