שיפור רבייה כדי לענות על מידע מינימלי למחקרים של שלפוחיות חוץ-תאיות 2018 הנחיות בניתוח מעקב חלקיקים

Summary

ניתוח מעקב ננו-חלקיקים (NTA) היא שיטה נפוצה לאפיון שלפוחיות חוץ-תאיות. מאמר זה מדגיש פרמטרים ובקרות ניסיוניים של NTA בתוספת שיטה אחידה של ניתוח ואפיון של דגימות ודילולים הדרושים כדי להשלים את ההנחיות המוצעות על ידי MISEV2018 ו- EV-TRACK לשחזור בין מעבדות.

Abstract

ניתוח מעקב חלקיקים (NTA) היה אחד מכמה שיטות אפיון המשמשות למחקר שלפוחית חוץ תאית (EV) מאז 2006. רבים סבורים כי מכשירי NTA וחבילות התוכנה שלהם יכולים להיות מנוצלים בקלות לאחר אימון מינימלי וכי כיול גודל הוא אפשרי בתוך הבית. כמו רכישת NTA וניתוח תוכנה מהווים אפיון EV, הם מטופלים במידע מינימלי למחקרים של שלפוחיות חוץ תאיות 2018 (MISEV2018). בנוסף, הם כבר במעקב על ידי דיווח שקוף וריכוז ידע במחקר שלפוחית חוץ תאית (EV-TRACK) כדי לשפר את החוסן של ניסויי EV (למשל, למזער וריאציה ניסיונית עקב גורמים בלתי מבוקרים).

למרות המאמצים לעודד דיווח על שיטות ובקרות, מאמרי מחקר רבים שפורסמו אינם מדווחים על הגדרות קריטיות הדרושות לשחזור התצפיות המקוריות של נת”ע. מאמרים מעטים מדווחים על אפיון NTA של פקדים שליליים או דילול, ככל הנראה בהנחה כי מוצרים זמינים מסחרית, כגון תמיסת מלח חוצצת פוספט או מים מזוקקים אולטרה-פור, הם ללא חלקיקים. באופן דומה, פקדים חיוביים או תקני גודל מדווחים רק לעתים רחוקות על ידי חוקרים כדי לאמת את גודל החלקיקים. משוואת סטוקס-איינשטיין משלבת צמיגות מדגם ומשתני טמפרטורה כדי לקבוע תזוזת חלקיקים. דיווח על טמפרטורת תא הלייזר היציבה במהלך כל איסוף הווידאו לדוגמה הוא, אם כן, אמצעי בקרה חיוני לשכפול מדויק. הסינון של דגימות או דילולים גם אינו מדווח באופן שגרתי, ואם כן, הפרטים של המסנן (יצרן, חומר ממברנה, גודל נקבוביות) ותנאי אחסון כלולים לעתים רחוקות. הסטנדרטים המינימליים של האגודה הבינלאומית לשלפוחית חוץ-תאית (ISEV) של פירוט ניסיוני מקובל צריכים לכלול פרוטוקול NTA מתועד היטב לאפיון של רכבים חשמליים. הניסוי הבא מספק ראיות לכך שפרוטוקול ניתוח NTA צריך להיקבע על ידי החוקר הבודד ולהיכלל בשיטות הפרסומים המשתמשים באפיון נת”ע כאחת האפשרויות למילוי דרישות MISEV2018 לאפיון שלפוחית יחיד.

Introduction

ניתוח מדויק וחוזר על עצמו של רכבים חשמליים וחלקיקים אחרים בקנה מידה של ננומטר מציב אתגרים רבים במחקר ובתעשייה. שכפול של מחקר EV היה קשה, בין היתר, בשל חוסר אחידות בדיווח על הפרמטרים הדרושים הקשורים לאיסוף נתונים. כדי לטפל בליקויים אלה, ISEV הציע הנחיות תעשייה כמערכת מינימלית של סטנדרטים ביוכימיים, ביופיזיים ותפקודיים לחוקרי EV ופרסם אותם כהצהרת עמדה, המכונה בדרך כלל MISEV2014¹. הקצב המואץ של מחקר EV דרש הנחיה מעודכנת, ואת “MISEV2018: הצהרת עמדה של ISEV” הרחיב את הנחיות MISEV2014². נייר MISEV2018 כלל טבלאות, קווי מתאר של פרוטוקולים מוצעים וצעדים שיש לבצע כדי לתעד אפיון ספציפי הקשור לרכב חשמלי. כאמצעי נוסף להקלה על פרשנות ושכפול של ניסויים, EV-TRACK פותחה כבסיס ידע מיקור המונים (http://evtrack.org) כדי לאפשר דיווח שקוף יותר של ביולוגיה של EV והמתודולוגיה המשמשת לתוצאות^{שפורסמו 3}. למרות המלצות אלה לדיווח סטנדרטי של שיטות, התחום ממשיך לסבול משכפול ואישור תוצאות שפורסמו.

בהתאם למאמץ של המכונים הלאומיים לבריאות והקרן הלאומית למדע עבור כלי הערכת איכות, מאמר זה מציע כי ISEV דורש דיווח סטנדרטי של שיטות ופרטים, כך שכלי הערכת נתונים עשויים להיות מיושמים במטרה לשכפל תוצאות בין מעבדות. דיווח על מקורות תאים, נהלי תרבית תאים ושיטות בידוד EV הם גורמים חשובים להגדרת התכונות של אוכלוסיית הרכב החשמלי. בין מכשירי NTA, גורמים כגון הגדרות זיהוי, מדד השבירה של נוזל נשא, אוכלוסיות חלקיקים הטרוגניות התורמות לפולידיספרסיביות, היעדר דרישות דיווח סטנדרטיות ותוצאות מדידה פנים-צופיות נעדרות הופכות את השוואת NTA בין מעבדות לקשה או בלתי אפשרית.

בשימוש מאז 2006, NTA היא שיטה פופולרית עבור גודל חלקיקים וקביעת ריכוז המשמש כיום על ידי כ 80% של חוקרי EV⁴. הנחיות MISEV2018 דורשות שתי צורות של ניתוח שלפוחית אחת, אשר NTA היא אחת האפשרויות הפופולריות. נת”ע ממשיכה להיות בשימוש נפוץ לאפיון EV בשל הנגישות הרחבה שלה, עלות נמוכה לדגימה, ותורת המייסדים הפשוטה שלה (משוואת סטוקס-איינשטיין). הערכת EV על ידי NTA מייצרת התפלגות גודל חלקיקים והערכת ריכוז באמצעות פיזור אור לייזר וניתוח תנועה בראונית, כאשר הגבול התחתון של הזיהוי נקבע על ידי מדד השבירה של הרכב החשמלי. בעת שימוש בדגימת נוזלים של צמיגות וטמפרטורה ידועות, המסלולים של הרכבים החשמליים נמצאים במעקב כדי לקבוע את תזוזתם הממוצעת בריבוע בשני ממדים. זה מאפשר את מקדם פיזור החלקיקים להיות מחושב ומומר לקוטר הידרודינמי שווה ערך לכדור על ידי משוואת סטוקס-איינשטיין שונה ^5,6,7. ניתוח חלקיקים לחלקיקים של NTA יש פחות הפרעות על ידי agglomerates או חלקיקים גדולים יותר באוכלוסייה הטרוגנית של רכבים חשמליים מאשר שיטות אחרות של אפיון⁷. בעוד כמה חלקיקים גדולים יותר יש השפעה מינימלית על דיוק גודל, נוכחות של כמויות דקות אפילו של חלקיקים גדולים, פיזור אור גבוה גורם לירידה ניכרת בזיהוי של חלקיקים קטנים יותר עקב זיהוי EV תוכנה מופחתת ומעקב⁸. כטכניקת מדידה, NTA נחשב בדרך כלל לא מוטה כלפי חלקיקים גדולים יותר או אגרגטים של חלקיקים, אבל יכול לפתור אוכלוסיות מרובות גודל באמצעות ניתוח חלקיקים בודדים⁹. בגלל השימוש בפיזור אור על ידי חלקיקים, אחת המגבלות של ניתוח NTA היא שכל חלקיק כגון אבק, פלסטיק, או אבקה עם תכונות שבירה וגודל דומות בהשוואה לרכבים חשמליים לא ניתן להבדיל מרכבים חשמליים בפועל בשיטה זו של אפיון.

NanoSight LM10 (מנתח גודל ננו-חלקיקים) ו- LM14 (מודול לייזר) נמכרו מאז 2006, ולמרות שדגמים חדשים יותר של מכשיר זה פותחו, דגם מסוים זה נמצא במתקני ליבה רבים ונחשב לסוס עבודה אמין. יש צורך בהכשרה כדי לייעל כראוי את הגדרות ה- NTA למדידות ברזולוציה גבוהה של גודל וריכוז. שתי ההגדרות החשובות הדרושות להקלטות וידאו אופטימליות הן (1) רמת המצלמה ו- (2) סף האיתור. אלה חייבים להיות מוגדרים על ידי האופרטור בהתבסס על מאפייני המדגם. אחד האילוצים העיקריים של ניתוח NTA הוא ההמלצה של ריכוזי מדגם בין 10⁷ ו 10⁹ חלקיקים / מ”ל, כדי להשיג דילול מדגם זה עשוי להידרש¹⁰. פתרונות המשמשים לדילול, כגון תמיסת מלח חוצצת פוספט, תמיסת מלח 0.15 M, או מים אולטרה-פור, הם לעתים רחוקות ללא חלקיקים פחות מ 220 מיקרומטר בגודל, אשר עשוי להשפיע על מדידות NTA. אפיון נת”ע של הפתרונות המשמשים לדילול צריך להתבצע באותה רמת מצלמה וסף זיהוי כמו דגימות ננו-חלקיקים המנותחות. הגודל והריכוז של חלקיקים הנמצאים בדילולים המשמשים לדילול מדגם EV נכללים לעתים רחוקות בפרסומים הכוללים ניתוח NTA של רכבים חשמליים.

פרוטוקול זה משתמש בניתוח NTA של ליפוזומים סינתטיים דמויי EV המוערך באמצעות רמות מצלמה נבחרות, סף זיהוי וסינון מכני של הדגימות כדי לנתח את ההשפעות השיטתיות של רמת המצלמה, סף הזיהוי או סינון מדגם בערכת הנתונים של NTA. ליפוזומים היו מסונתזים כמתואר בקובץ משלים S1. ליפוזומים סינתטיים שימשו בניסוי זה בגלל אחידות הגודל שלהם, מאפיינים פיזיים, ויציבות באחסון ב 4 °C (60 °F). למרות שניתן היה להשתמש בדגימות בפועל של רכבים חשמליים, ההטרוגניות והיציבות של כלי רכב חשמליים במהלך האחסון עשויות לסבך את המחקר הזה ואת הפרשנות שלו. קווי דמיון בדו”חות נת”ע מ-(A) ליפוזומים ו-(B) רכבים חשמליים מצביעים על כך שההשפעות השיטתיות שיחשפו לליפוזומים במאמר זה יחולו ככל הנראה גם על אפיון רכב חשמלי (איור 1). יחד, ממצאים אלה תומכים ברעיון שדיווח מלא של הגדרות תוכנה קריטיות ותיאור עיבוד מדגמי, כגון דילול, דילול וסינון, משפיעים על יכולת השחזור של נתוני NTA.

מטרת מאמר זה היא להדגים כי הושגו שינויים בהגדרות נת”ע (טמפרטורה, רמת מצלמה וסף איתור) והכנת מדגם לשינויים בתוצאות שנאספו: התקבלו הבדלים שיטתיים ומשמעותיים בגודל ובריכוז. כמו NTA היא אחת האפשרויות הפופולריות כדי למלא את מפרט האפיון MISEV2018, תוצאות אלה ממחישות את החשיבות של דיווח הכנת מדגם והגדרות NTA כדי להבטיח רבייה.

איור 1: נציג NTA מדווח על השוואת ליפוזומים לרכבים חשמליים. (א) ליפוזומים: מדגם לא מסונן המאופיין ב- NTA ב- 12 במרץ 2020. (ב) רכבים חשמליים: מדגם לא מסונן המאופיין ב- NTA ב- 26 באוגוסט 2021. קיצורים: NTA = ניתוח מעקב אחר חלקיקים; רכבים חשמליים = שלפוחיות חוץ-תאיות. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Protocol

1. הנחיות כלליות לפרוטוקול שמור על המיקרוסקופ על שולחן אוויר או לכל הפחות על שולחן ללא רטט. ודא כי תנודות חיצוניות (למשל, הקשה ברגל על הרצפה, נגיעה בשולחן, סגירת דלתות, תנועת מעבדה) נשמרות למינימום. הגדר ושמור על הטמפרטורה של מודול הלייזר בטמפרטורה קבועה עבור כל הקלטות הו?…

Representative Results

טבלה 1 מכילה את התוצאות של סרטוני NTA עבור דגימות הליפוזום (18 מסוננות ו-18 לא מסוננות) ודילול DPBS מייצג. ההשוואות בין שתי הקבוצות הושלמו ללא קשר לרמת המצלמה או לסף הזיהוי במאמר זה. דגימות מסוננות היו קוטר חלקיקים ממוצע של 108.5 ננומטר, מצב חלקיקים של 86.2 ננומטר, וריכוז של 7.4 × 108 חלקיקי…

Discussion

ישנן מספר שיטות זמינות כדי להעריך את הגודל והריכוז של חלקיקים¹¹. אלה כוללים שיטות אנסמבל המייצרות הערכת גודל מאוכלוסייה, כולל פיזור אור דינמי (DLS), משקעים צנטריפוגליים, ומיקרוסקופיה של רמת חלקיק יחיד-אלקטרון, NTA, מיקרוסקופיה של כוח אטומי וחישת דופק התנגדותית טונה. מתוכם, DLS ו- NTA נ…

Materials

Automatic Pipetter
Centrifuge Tubes, Conical, Nunc 15 mL	Thermo Sci.	339650
Kimwipes
Lens Cleaner
Lens Paper
NanoSight LM-10	Malvern Panalytical
NanoSight LM-14 Laser Module	Malvern Panalytical
Nanosight NTA Software Ver. 3.2	Malvern Panalytical
Paper Towels
Pipette Tips, 1-200 µL, Filtered, Sterile, Low Binding	BioExpress	P -3243-200X
Pipette Tips, 50-1,000 µL, Filtered, Sterile	BioExpress	P-3243-1250
Saline, Dulbecco's Phosphate Buffered (No Ca or Mg)	Gibco	14190-144
Standards, Latex Transfer- 100 nm (3 mL)	Malvern	NTA4088
Standards, Latex Transfer- 50 nm  (3 mL)	Malvern	NTA4087
Syringe Filter, 33 mm, .22 µm, MCE, Sterile	Fisher brand	09-720-004
Syringe, TB, 1 mL, slip tip	Becton Dickinson	309659
Waste fluid container