본 프로토콜은 동위원소 골육종 및 폐 전이 병변을 지닌 마우스 모델을 생성하기 위해 경막내 골육종 세포 주사를 기술한다.
골육종은 어린이와 청소년에서 가장 흔한 원발성 골암으로, 폐가 가장 흔한 전이성 부위입니다. 폐 전이 골육종 환자의 5 년 생존율은 30 % 미만입니다. 따라서, 인간에서 골육종 발달을 모방한 마우스 모델의 활용은 골육종 발암 및 폐전이의 근본적인 기전을 이해하여 새로운 치료제를 개발하는 데 큰 의미가 있다. 여기서, 상세한 절차는 골육종 세포의 경골 내 주사를 통해 원발성 골육종 및 폐 전이 마우스 모델을 생성하는 것으로 보고된다. 생체 발광 또는 X 선 라이브 이미징 시스템과 결합된이 살아있는 마우스 모델은 골육종 성장 및 전이를 모니터링하고 정량화하는 데 사용됩니다. 이 모델을 확립하기 위해, 골육종 세포를 함유하는 기저막 매트릭스를 마이크로-부피 주사기에 로딩하고, 마취 후 각 흉선 마우스의 하나의 경골에 주입하였다. 원발성 골육종이 IACUC 승인 프로토콜에서 크기 제한에 도달했을 때 마우스를 희생시켰다. 골육종을 앓고있는 다리와 전이 병변이있는 폐가 분리되었습니다. 이들 모델은 짧은 잠복기, 빠른 성장, 중증 병변 및 원발성 및 폐 전이성 병변의 발달을 모니터링하는 데 있어서 민감성을 특징으로 한다. 따라서, 이들은 골육종 암화 및 폐 전이, 종양 미세환경에서 특정 인자의 기능 및 기작을 탐구하고, 생체 내에서 치료 효능을 평가하기 위한 이상적인 모델이다.
골육종은 어린이와 청소년에서 가장 흔한 원발성 골암으로 1,2 주로 주변 조직에 침투하고 환자가 진단 될 때 폐로 전이됩니다. 폐 전이는 골육종 치료의 주요 과제이며, 폐 전이 환자의 5 년 생존율은 20 % -30 % 3,4,5만큼 낮습니다. 그러나, 원발성 골육종의 5년 생존율은 화학요법6의 도입으로 인해 1970년대 이후 약 70%로 증가하였다. 따라서 새로운 치료법을 개발하기 위해서는 골육종 발암과 폐전이의 근본적인 메커니즘을 이해하는 것이 시급히 필요하다. 인간의 골육종 진행을 가장 잘 모방하는 마우스 모델의 적용은 매우 중요합니다7.
골육종 동물 모델은 자발적이고 유도 된 유전 공학, 이식 및 기타 기술에 의해 생성됩니다. 자발적인 골육종 모델은 긴 종양 형성 시간, 일관성 없는 종양 발생률, 낮은 이환률 및 불량한 안정성 8,9로 인해 거의 사용되지 않는다. 유도된 골육종 모델이 자발적인 골육종보다 수득하기에 더 접근하기 쉽지만, 유도 인자가 골육종(10)의 미세환경, 병인, 및 병리학적 특성에 영향을 미치기 때문에 유도된 골육종 모델의 적용은 제한적이다. 트랜스제닉 모델은 인간의 생리적 및 병리학적 환경을 더 잘 시뮬레이션할 수 있기 때문에 암의 발병기전을 이해하는 데 도움을 준다; 그러나, 트랜스제닉 동물 모델은 또한 트랜스제닉 변형의 어려움, 장기간 및 높은 비용으로 인해 그들의 한계를 갖는다. 더욱이, p53 및 Rb 유전자 변형에 의해 생성된 가장 널리 수용된 형질전환 동물 모델에서조차도, 육종의 13.6%만이 네 개의 사지뼈11,12에서 발생하였다.
이식은 간단한 기동, 안정한 종양 형성 속도 및 더 나은 균질성13으로 인해 최근 몇 년 동안 가장 일반적으로 사용되는 원발성 및 원거리 전이성 암 모델 생산 방법 중 하나입니다. 이식은 이식 부위에 따른 이종국소 이식 및 동위원소 이식을 포함한다. 골육종 이종 이식에서, 골육종 세포는 동물의 원발성 골육종 부위(뼈) 외부에, 일반적으로 피부 아래에, 피하14로 주사된다. 이종 국소 이식은 동물에서 수술을 수행 할 필요없이 간단하지만 골육종 세포가 주입되는 부위는 실제 인간 골육종 미세 환경을 나타내지 않습니다. 골육종 동위원소 이식은 골육종 세포가 경골15,16과 같은 동물의 뼈에 주입되는 경우이다. 이종 토픽 이식편과 비교하여, 동위원소 골육종 이식편은 짧은 잠복기, 빠른 성장 및 강한 침식 성질을 특징으로합니다. 따라서, 그들은 골육종 관련 연구17에 이상적인 동물 모델입니다.
가장 일반적으로 사용되는 동물은 생쥐, 개 및 제브라 피쉬18,19입니다. 골육종의 자발적 모델은 골육종이 송곳니에서 가장 흔한 종양 중 하나이기 때문에 일반적으로 송곳니에서 사용됩니다. 그러나, 이 모델의 적용은 긴 종양 형성 시간, 낮은 종양 생성 속도, 불량한 균질성 및 안정성 때문에 제한된다. 제브라피쉬는 빠른 번식(20)으로 인해 형질전환 또는 녹아웃 종양 모델을 구축하는데 종종 사용된다. 그러나 제브라피쉬 유전자는 인간 유전자와 다르기 때문에 그 적용이 제한적입니다.
이 연구는 흉선 마우스에서 골육종 세포의 경골 내 주사를 통해 폐 전이와 함께 경골에서 원발성 골육종을 생산하기위한 상세한 절차, 예방 조치 및 대표적인 이미지를 설명합니다. 이 방법은 치료 효능 평가를 위해 마우스 경골에서 원발성 골육종을 만들기 위해 적용되었으며, 이는 높은 재현성21,22를 나타내었다.
골육종 세포의 동위원소 주사는 골육종 발암에 있어서 특정 인자의 기능 및 기전을 연구하고 치료 효능을 평가하기 위해 개발하기에 이상적인 모델이다. 종양 성장의 차이를 피하기 위해 동일한 수의 80 % -90 % 합류에서 대부분의 활성 골육종 세포를 각 마우스의 경골에 조심스럽게 주입하고 세포 트립신화 시간은 세포 생존력에 영향을 미치지 않고 엄격하게 제어됩니다. 세포 덩어리가 세포 계수?…
The authors have nothing to disclose.
이 연구는 (1) 중국의 국가 핵심 R & D 프로그램 (2018YFC1704300 및 2020YFE0201600), (2) 국립 자연 과학 재단 (81973877 및 82174408)의 보조금으로 지원되었습니다.
Automatic cell counter | Shanghai Simo Biological Technology Co., Ltd | IC1000 | Counting cells |
Anesthesia machine | Shenzhen RWD Life Technology Co., Ltd | R500IP | The Equipment of Anesthesia mice |
BALB/c athymic mice | Shanghai SLAC Laboratory Animal Co, Ltd. | / | animal |
Basement Membrane Matrix | Shanghai Uning Bioscience Technology Co., Ltd | 356234, BD, Matrigel | re-suspende cells |
Bioluminescence imaging system | Shanghai Baitai Technology Co., Ltd | Vieworks | tracking the tumor growth and pulmonary metastasis, if the injection cell is labeled by luciferase |
Centrifuge tube (15 mL) | Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd | 430790, Corning | Centrifuge the cells |
isoflurane | Shenzhen RWD Life Technology Co., Ltd | VETEASY | Anesthesia mice |
MEM media | Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd | LM-E1141 | Cell culture medium |
Micro-volume syringe | Shanghai high pigeon industry and trade Co., Ltd | 0-50 μL | Inject precise cells into the tibia |
Phosphate-buffered saline | Beyotime Biotechnology | ST447 | wash the human osteosarcoma cells |
1ml syringes | Shandong Weigao Group Medical Polymer Co., Ltd | 20200411 | drilling |
143B cell line | ATCC | CRL-8303 | osteosarcoma cell line |
Trypsin (0.25%) | Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd | 25200056, Gibco | trypsin treatment of cells |
Trypan blue | Beyotime Biotechnology | ST798 | Staining cells to assess activity |
vector (pLV-luciferase) | Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd | VL3613 | Plasmid |
Lipofectamine 2000 | Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd | 11668027,Thermo fisher | Plasmid transfection reagent |
X-ray imaging system | Brook (Beijing) Technology Co., Ltd | FX PRO | X-ray images were obtained to detect tumor growth |