כאן, אנו מציגים פרוטוקול לשיפור ההצלחה של פלואורסצנטיות בין פאזית בזיהוי הכלאה במקום על מריחות מח עצם מחולי מיאלומה נפוצים.
פלואורסצנטיות בזיהוי הכלאה במקום (FISH) היא שיטה הכרחית בריבוד סיכונים גנטיים במיאלומה נפוצה (MM), שהיא אחת ממאירות המטולוגיות הנפוצות ביותר. המאפיין המזהה של MM מצטבר תאי פלזמה ממאירים במח העצם. דוחות דגים עבור MM מתמקדים בעיקר בתאי פלזמה קלונליים מטוהרים או מזוהים, ולא בכל התאים הגרעינים, על ידי מיון עם חרוזים מגנטיים נגד CD138 או סימון עם שרשרת אור אימונוגלובולין ציטופלסמית κ או λ. גרעינים אינטרפאזי מח עצם מתקבלים בדרך כלל מתאי מח עצם טריים. עם זאת, העשרה משביעת רצון של דגימות תאי פלזמה דורשת כמויות גדולות של מח עצם טרי נגד מח עצם, אשר לא ניתן להשיג במקרה של מיצוי מח עצם קשה או ברז יבש מח עצם. בזאת, אנו מקימים שיטה חדשנית כדי לשפר את ההצלחה של זיהוי דגים על כתמי מח עצם מוכתמים או לא מוכתמים. כתמי מח עצם קלים יותר להשגה מאשר דגימות מח עצם נוגדות קרישה.
מיאלומה נפוצה (MM) היא מחלת תאי פלזמה ממאירים (PC) עם הטרוגניות ביולוגית חזקה והבדלים אישיים גדולים ביעילות קלינית, עם תקופות הישרדות הנעות בין חודשים לעשורים. מאפיינים ציטוגנטיים הם אינדיקטורים פרוגנוסטיים חשובים של MM. מערכת ריבוד הסיכון וטיפולים מותאמים אישית המבוססים על מאפיינים גנטיים הפכו לנושאים בעלי עניין רב במחקר קליני על MM1. הסטיות של מחשבים שנבדקו בפלואורסצנטיות בלוח היברידיזציה של סיטו (FISH) של מח העצם (BM) כוללות דל 13q14 (RB1), del 17p13 (TP53), t(4;14) (IGH/FGFR3), t(11;14) (IGH/MYEOV), t(14;16) (IGH/MAF), t (14:20) (IGH/MAFB), 1q21 (CKS1B) רווח/הגברה, ומחיקת 1p (CDKN2C).
ציטוגנטיקה מטפאזה סטנדרטית צריכה להיכלל בהערכה הראשונית של חולי MM. למרות kryotyping רגיל G-פס מציע את היתרון של ניתוח כרומוזום שלם, התשואה הנמוכה של שיטה זו מובילה לתוצאות שליליות כוזבות רבות2. באופן מסורתי, מחשבים נתפסו כבלתי מסוגלים במידה רבה לפיצול מכיוון שהם המוצרים הסופיים של בידול לימפוציטים B. הדבר מקשה על השגת תמונות מפוצלות. ניתוח ציטוגנטי משופר ב- MM עם תרביות לטווח ארוך (6 ימים) וגירוי של תרבויות על ידי ציטוקינים עשוי להיות שיטה מבטיחה לזיהוי חריגות ציטוגנטיות בחולי MM שאובחנו לאחרונה3. גם כאשר זמן התרבות היה ממושך עד 6 ימים, עם זאת, חריגות ציטוגנטיות דווחו במדויק ב 30%-50% של חולי MM4. יתר על כן, MM מאופיין בסטיות ציטוגנטיות מורכבות המשקפות את ההטרוגניות הפרוגנוסטית שלו. עם זאת, הרזולוציה של טכנולוגיית פסים כרומוזום מסורתית היא נמוכה, אשר עלול בקלות להוביל לזיהוי חסר של חריגות כרומוזומלי ב- MM.
דג אינטרפאזה, רצוי לאחר CD138-חיובי חרוז מגנטי מבוסס מיון מחשב או סימון עם שרשרת אור אימונוגלובולין cytoplasmic κ/λ, הוא הכרחי בניתוח של MM5,6. מדגם נבחר CD138 חיובי מומלץ מאוד עבור התשואה הממוטבת של תאים סרטניים. עם זאת, כמות מדויקת של סטיות ציטוגנטיות דורשת לפחות 4 מ”ל של BM אנטי-קולוגי למיון מחשב. בנוסף, השילובים של מיון חרוזים אימונומגנטיים CD138 עם FISH או אימונוגלובולין שרשרת אור ציטופלסמית κ /λ עם בדיקות דגים (cIg-FISH) להגדיל עלויות ניסיוניות רבות והם גוזלים זמן רב.
בדרך כלל, יחס המחשב מוערך תחילה מהבדיקה המורפולוגית של מריחות BM מוכתמות או מקטעי ביופסיה BM7,8. דגימות BM באיכות הגבוהה ביותר (דגימות שאיפה של מח ראשון) משמשות לבדיקות מורפולוגיות, ואילו אלה שנשלחו לדוג או לגילוי אחר הן לעתים קרובות דגימות שאיפה משניות עם יחס גבוה של דילול עם דם היקפי.
כבר בשנות ה-90 של המאה ה-20, מחקרים רבים הראו כי מריחות BM יכולות לשמש ישירות לבדיקות דגים ביניים, שהוכיחו את עצמן כשיטה אמינה וניתן לחזור עליהן9. מחקר אלגנטי המבוסס על מורפולוגיה של תאים וציטוכימיה אסטראז בשילוב עם FISH של דם היקפי וכתמי BM אישר את המשמעות הקלינית הגדולה שלו להבהרת חריגות כרומוזומליות בחולים עם לוקמיה גרנולוציטית ולימפוציטית10.
להלן, אנו מספקים שיטה חדשנית לשיפור ההצלחה של זיהוי דגים interphase בחולי MM.
היישום של דגים לריבוד סיכון גנטי ב- MM הוא חיוני. החלק הקריטי של דוחות FISH הוא לא כל התאים הגרעינים, אבל מחשבים קלונליים מטוהרים או מזוהים במיוחד על ידי מיון עם חרוזים מגנטיים נגד CD138 או סימון עם שרשרת אור אימונוגלובולין ציטופלסמית κ או λ. אינטרפאזה FISH לאחר מיון מחשב או cIg-FISH נמצאה משמעותית באב?…
The authors have nothing to disclose.
פרויקט זה נתמך על ידי קרן החדשנות של WNLO 2018WNLOKF023.
automatic FISH machine | Leica Corporation | S500-24 | FINAL Assy Thermobrite 240V |
DAPI | Abbott Molecular Inc. | 06J49-001 | DAPI Counterstain |
FISH Analysis Software | IMSTAR Corporation | IMSTAR | FISH Analysis Software |
FISH Probe | Abbott Molecular Inc. | 05N56-020 | Vysis Locus Specifc Identifer TP53 / CEP 17 FISH Probe Kit |
Fixed volume pipette | Eppendorf China Ltd. | M33768H | 10 microliter |
Fluorescence Microscope | Olympus Corporation | BX53 | Forward Fluorescence Microscope |
Karyotype Analysis Software | IMSTAR Corporation | IMSTAR | Karyotype Analysis Software |
Light Microscope | Olympus Corporation | BX41 | Forward Light Microscope |
NP-40 | Abbott Molecular Inc. | 07J05-001 | NP-40 |
Plastic staining dyeing rack | Guangzhou Kaixiu Trading Co., Ltd. | RSJ-501 | 24 slides |
Plastic staining dyeing tank | Guangzhou Kaixiu Trading Co., Ltd. | RSJ-516 | 24 slides |
Rubber Cement | Marabu GmbH & Co. KG | FixoGum | Rubber Cement |
SSC | Abbott Molecular Inc. | 02J10-032 | 20×SSC |
Water bath | Shanghai Boxun Medical Bio-Instrument Co., Ltd. | DK-8D | Multiple Temperature Water bath |