Der mikroskopiebasierte Assay zur Untersuchung und Analyse der Recycling-Endosomen mittels SNARE-Trafficking
Summary
Recycling-Endosomen sind Teil des endosomalen tubulären Netzwerks. Hier stellen wir eine Methode zur Quantifizierung der Dynamik von Recycling-Endosomen mit GFP-STX13 als Organellenmarker vor.
Abstract
Recycling-Endosomen (REs) sind röhrenförmig-vesikuläre Organellen, die aus frühen/sortierenden Endosomen in allen Zelltypen erzeugt werden. Diese Organellen spielen eine Schlüsselrolle bei der Biogenese von Melanosomen, einer Lysosom-verwandten Organelle, die von Melanozyten produziert wird. REs liefern die Melanozyten-spezifische Fracht während ihrer Bildung an vorzeitige Melanosomen. Eine Blockade bei der Erzeugung von REs, die bei mehreren Mutanten des Hermansky-Pudlak-Syndroms beobachtet wird, führt zu einer Hypopigmentierung von Haut, Haaren und Auge. Daher ist das Studium der Dynamik (siehe Anzahl und Länge) von REs nützlich, um die Funktion dieser Organellen unter normalen und Krankheitsbedingungen zu verstehen. In dieser Studie wollen wir die RE-Dynamik mit einem residenten SNARE STX13 messen.
Introduction
Die Biosynthese von Melaninpigmenten erfolgt in Melanosomen, einer melanozytenspezifischen Lysosomen-verwandten Organelle (LRO), die mit herkömmlichen Lysosomen koexistiert. Das endozytäre System spielt eine Schlüsselrolle bei der Biogenese von Melanosomen, die für die Hautfarbe und den Strahlenschutz gegen ionisierende Strahlung erforderlich ist1,2,3. Während dieses Prozesses werden die melaninsynthetisierenden Enzyme auf frühen / sortierenden Endosomen sortiert und dann durch tubuläre oder vesikuläre Endosomen, die recycling-Endosomen (REs) genannt werden, zu vorzeitigen Melanosomen transportiert 4,5,6,7,8,9,10. Das Targeting und die Fusion dieser Organellen regulieren die Reifung voll funktionsfähiger pigmentierter Melanosomen7,11,12,13,14. Defekte bei der Bildung dieser Organellen oder der Ladungssortierung zu diesen Organellen verursachen okulokutanen Albinismus und andere klinische Phänotypen, die beim Hermansky-Pudlak-Syndrom beobachtet wurden15,16.
Hier beschreiben wir eine einfache mikroskopiebasierte Technik, um die REs zu untersuchen und zu analysieren. Bei dieser Methode haben wir ein Transmembranprotein, Qa-SNARE Syntaxin (STX)13, genutzt, das sich auf Recycling-Endosomen17 und Zyklen zwischen sortierenden Endosomen und Melanosomen in Melanozyten befindet12,18. Darüber hinaus ermöglicht die Deletion der N-terminalen unstrukturierten regulatorischen Domäne (nämlich SynN oder STX13Δ129), dass die SNARE in Melanosomen stecken bleibt, was den Vorwärtstransportweg zum Melanosom misst12. Wir haben in unseren Studien einen bekannten recyclingenden endosomalen Marker Rab GTPase (Rab)11 verwendet14,19. Die Fluoreszenzbildgebung der Proteine GFP-STX13WT, GFP-STX13Δ129, mCherry-Rab11 und TYRP1 in Wildtyp-Melanozyten mit anschließender Quantifizierung ihrer relativen Lokalisation wird die Art und Dynamik von REs zusätzlich zu ihrem Targeting auf Melanosomen liefern. Somit ist dies eine einfache Technik, die verwendet werden kann, um die Dynamik von REs in Melanozyten zu visualisieren und zu messen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Recycling-Endosomen sind eine Kohorte endozytärer Organellen und vermitteln das Recycling von Fracht an die Zelloberfläche in allen Zelltypen21,22,23,24,25. In spezialisierten Zelltypen wie Melanozyten lenken diese Organellen ihren Transportweg teilweise auf die Melanosomen für ihre Biogenese um3,16,26.</…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde vom Departement Biotechnologie unterstützt (BT/PR32489/BRB/10/1786/2019 an die SRGS); Science and Engineering Research Board (CRG/2019/000281 an die SRGS); DBT-NBACD (BT/HRD-NBA-NWB/38/2019-20 an SRGS) und IISc-DBT-Partnerschaftsprogramm (an SRGS). Die Infrastruktur in der Abteilung wurde durch DST-FIST, DBT und UGC unterstützt. AMB wurde von DBT-JRF (DBT/2015/IISc/NJ-02) unterstützt.
Materials
| anti-TYRP1 antibody (TA99) | ATCC | HB-8704 | |
| Fluoromount-G | Southern Biotech | 0100-01 | |
| Lipofectamine 2000 | ThermoFisher Scientific | 11668-500 | |
| Matrigel matrix | BD Biosciences | 356231 | |
| OPTI-MEM | ThermoFisher Scientific | 022600-050 | |
| Phorbol-12-myristate-13-acetate | Sigma-Aldrich | P8139 | |
| RPMI Medium 1640 | ThermoFisher Scientific | 31800-022 |
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