쥐 모델에서의 망막 병리생리학적 평가
Summary
당뇨병성 망막증은 실명의 주요 원인 중 하나입니다. 조직학, 혈액-망막 장벽 파괴 분석, 및 형광 혈관조영술은 망막의 병태생리학을 이해하는 데 유용한 기술이며, 이는 당뇨병성 망막병증에 대한 효율적인 약물 스크리닝을 더욱 향상시킬 수 있다.
Abstract
당뇨병성 망막병증과 같은 후부 절편 안구 질환은 망막의 생리학을 변화시킵니다. 당뇨병성 망막병증은 망막 박리, 혈액-망막 장벽(BRB)의 붕괴, 및 망막 혈관신생을 특징으로 한다. 생체 내 쥐 모델은 망막의 구조와 기능의 변화를 조사하는 데 유용한 실험 도구입니다. 우리는 망막 세포, 망막 혈관 구조 및 손상된 BRB의 형태 학적 변화를 확인하기 위해 쥐 모델에서 세 가지 실험 기술을 제안합니다. 망막 조직학은 다양한 망막 세포의 형태를 연구하는 데 사용됩니다. 또한, 정량적 측정은 망막 세포 수 및 상이한 망막층의 두께 측정에 의해 수행된다. BRB 분해 분석은 BRB의 분해로 인한 혈장에서 유리체 조직으로의 안구 외 단백질의 누출을 결정하는 데 사용됩니다. 형광 혈관 조영술은 FITC-덱스트란 염료를 사용하여 망막 혈관 구조를 시각화하여 혈관 신생 및 혈관 누출을 연구하는 데 사용됩니다.
Introduction
당뇨병성 망막병증(DR)은 진성 당뇨병의 가장 복잡한 이차적 합병증 중 하나이다. 또한 전 세계 노동 연령 인구에서 예방 가능한 실명의 주요 원인이기도합니다. 32.4 만 명의 시각 장애인에 대한 최근의 메타 분석에서 830,000 (2.6 %)의 사람들이 DR1로 인해 시각 장애인이었습니다. 당뇨병으로 인한 시력 손실의 비율은 2015 년 전 세계적으로 1.06 % (0.15-2.38)로 7 위를 차지했습니다 2,3.
당뇨병성 망막병증은 후부 안구 조직의 혈관 이상에 의해 진단된다. 임상적으로, 망막에서의 혈관화에 기초한 비증식성 DR (NPDR) 및 증식성 DR (PDR)의 두 단계로 나뉘어진다. 고 혈당증은 망막의 신경 변성4,5, 염증6,7 및 미세 혈관 구조8에 관련된 여러 경로를 암시하기 때문에 DR의 강력한 조절제로 간주됩니다. 고혈당증으로 인해 유도되는 다중 대사 합병증에는 고급 당화 최종 생성물 (AGEs), 폴리올 경로, 헥소사민 경로 및 단백질 키나아제-C 경로의 축적이 포함된다. 이러한 경로는 당뇨병성 망막병증의 여러 단계에 기초한 세포 증식(내피 세포), 이동(혈관주위세포) 및 아폽토시스(신경 망막 세포, 혈관주위세포 및 내피 세포)를 담당한다. 이러한 대사 변화는 망막 박리, 망막 세포의 손실, 혈액 망막 장벽 (BRB)의 붕괴, 동맥류 및 혈관신생9과 같은 생리적 변화를 일으킬 수 있습니다.
스트렙토조토신 (STZ) 유도 제1형 당뇨병은 당뇨병 발병기전과 그 합병증을 평가하기 위한 쥐에서 잘 정립되고 잘 받아들여지는 관행이다. STZ의 당뇨병 유발 효과는 췌장섬 β 세포의 선택적 파괴에 기인한다10. 결과적으로, 동물들은 인슐린 결핍, 고혈당증, 폴리 딥시아 및 다뇨증을 겪을 것이며, 이들 모두는 인간 유형 1 당뇨병의 특징입니다 11. 심한 당뇨병 유발의 경우, STZ는 성인기에 정맥 내 또는 복강 내 40-65 mg / kg 체중으로 투여됩니다. 약 72 시간 후,이 동물들은 250 mg / dL10,12 이상의 혈당 수치를 나타냅니다.
신경 퇴행, 염증 및 혈관신생으로 인한 망막의 생리적 변화를 이해하려면 실험 동물 모델에서 다양한 기술을 최적화해야합니다. 망막 세포 및 망막 혈관의 구조적 및 기능적 변화는 조직학, BRB 분해 분석 및 형광 혈관조영술과 같은 다양한 기술에 의해 연구될 수 있다.
조직학은 현미경 수준에서 세포, 조직 및 기관의 해부학 연구를 포함합니다. 그것은 세포 / 조직의 구조와 기능 사이의 상관 관계를 수립합니다. 조직 구조의 미세한 변화를 시각화하고 식별하기 위해 몇 가지 단계가 수행되어 건강한 상대와 병든 상대물을 비교합니다13. 따라서 조직학의 각 단계를 세심하게 표준화하는 것이 필수적입니다. 망막 조직학에 관여하는 다양한 단계는 시편의 고정, 표본 트리밍, 탈수, 클리어링, 파라핀 함침, 파라핀 임베딩, 절편화 및 염색 (Hematoxylin and Eosin staining)13,14입니다.
건강한 망막에서, 망막을 가로지르는 분자의 수송은 BRB에 의해 조절되며, 내피 세포와 내측의 혈관주위세포, 그리고 바깥쪽의 망막 색소 상피 세포로 구성됩니다. 그러나, 내부 BRB 내피 세포 및 혈관주위세포는 병든 상태 동안 퇴화하기 시작하고, BRB도 또한 손상된다15. 이러한 BRB 분해로 인해 많은 저분자량 분자가 유리체 및 망막 조직으로 누출됩니다16. 질병이 진행됨에 따라 많은 다른 단백질 분자 (저분자량 및 고분자량)도 항상성 장애로 인해 유리체 및 망막 조직으로 누출됩니다17. 그것은 다양한 다른 합병증과 궁극적으로 황반 부종과 실명으로 이어집니다. 따라서 유리체의 단백질 수준을 정량화하고 건강한 상태와 당뇨병 상태를 비교하면 BRB가 손상되었습니다.
형광 혈관 조영술은 형광 염료를 사용하여 망막과 맥락막의 혈액 순환을 연구하는 데 사용되는 기술입니다. 정맥 내 경로 또는 심장 주사를 통해 플루오레세인 염료를 주입하여 망막과 맥락막의 혈관 구조를 시각화하는 데 사용됩니다18. 염료가 주입되면 먼저 망막 동맥에 도달하고 망막 정맥에 도달합니다. 염료의 이러한 순환은 일반적으로 염료19의 주입으로부터 5 내지 10분 이내에 완료된다. 당뇨병성 망막증과 맥락막 신생혈관화를 포함한 다양한 후부 절편 안구 질환을 진단하는 것은 중요한 기술이다20. 그것은 정상 및 병든 상태에서 크고 사소한 혈관 구조 변화를 감지하는 데 도움이됩니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
조직학
망막 조직학은 망막 세포 및 층의 형태학적 변화를 시각화하기 위해 수행된다. 고정 용액 선택, 고정 기간, 탈수 및 파라핀 함침을 포함한 다양한 단계를 최적화해야합니다. 조직 크기는 고정 침투가 느려지기 때문에 3mm를 초과해서는 안됩니다. 일반적으로 사용되는 4 % 파라 포름 알데히드는 수성 유머 및 유리체 유머에 비해 용액의 상대적으로 높은 삼투압으로 인해 건강한…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는 인도 의학 연구위원회 (ICMR; ITR-2020-2882) 박사 Nirmal J.에 대한 자금 지원 우리는 또한 인프라 시설을 제공 한 Manisha Malani 및 Central Analytical Laboratory Facility, BITS-Pilani, Hyderabad 캠퍼스에 주니어 연구 펠로우십을 제공 한 University Grant of Commission에 감사드립니다.
Materials
| Histology | |||
| Reagents | |||
| Isoflurane | Abbott | Anesthesia agent | |
| Ketamine hydrochloride | Troikaa Pharmaceuticals | Anesthesia agent | |
| Xylazine | Indian Immunologicals Limited | Anesthesia agent | |
| Pentobarbital sodium | Zora Pharma | Euthanesia agent | |
| Fixative solution (1 % formaldehyde, 1.25 % Glutaraldehyde | HiMedia, Avra | MB059, ASG2529 | Prepared in-house |
| Ethanol | Hayman | F204325 | Dehydration |
| Xylene | HiMedia | MB-180 | Clearing of ethanol or paraffin |
| Paraffin wax | HiMedia | GRM10702 | used for embedding tissue |
| Glycerol | HiMedia | TC503 | To prepare albumin coated slides. Glycerol and egg albumin is mixed in 1:1 ratio to coat on slides |
| Hydrochloric acid | Sisco Research laboratories Pvt. Ltd. | 65955 | For preparation of 1 % acid alcohol |
| Acetic acid | HiMedia | AS119 | For preparation of eosin |
| Scotts water | Leica | 3802900 | Bluing reagent |
| Papanicolaou's solution 1b Hematoxylin solution | Sigma | 1.09254.0500 | Staining of nuclei |
| Eosin | HiMedia | GRM115 | Staining of cytoplasm, 0.25 % solution was prepared in-house |
| DPX Mountant media | Sigma | 6522 | Visualization and protection of retinal sections |
| Equipments | |||
| Glassware | Borosil | ||
| Corneal forcep | Stephens Instruments | S5-1200 | Dissection |
| Colibri forcep | Stephens Instruments | S5-1135 | Dissection |
| Curved micro scissor | Stephens Instruments | S7-1311 | Dissection |
| Vannas scissor | Stephens Instruments | S7-1387 | Dissection |
| Iris scissor | Stephens Instruments | S7-1015 | Dissection |
| Cassettes | HiMedia | PW1292 | To hold tissue during histology processing |
| Water bath | GT Sonic | GT Sonic-D9 | Temperature maintenance |
| Paraffin embedding station | Myr | EC 350 | Preparation of paraffin blocks |
| Microtome | Zhengzhou Nanbei Instrument Equipment Co., Ltd. | YD-335A | Sectioning |
| Blades | Leica | Leica 818 | Sectioning |
| Slides | HiMedia | BG005 | Holding paraffin-tissue sections |
| Coverslips | HiMedia | BG014C | To cover tissue after adding mounting media |
| Blood Retinal Barrier breakdown | |||
| Reagents | |||
| Isoflurane | Abbott | B506 | Anesthesia |
| Dry ice | Not applicable | Not applicable | Dissection |
| Bradford reagent | Sigma | B6916 | Protein quantification |
| Equipments | |||
| Corneal forcep | Stephens Instruments | S5-1200 | Dissection |
| Colibri forcep | Stephens Instruments | S5-1135 | Dissection |
| Curved micro scissor | Stephens Instruments | S7-1311 | Dissection |
| Vannas scissor | Stephens Instruments | S7-1387 | Dissection |
| Iris scissor | Stephens Instruments | S7-1015 | Dissection |
| Glassware | Borosil | Not applicable | |
| EDTA coated tubes | J.K Diagnostics | Not applicable | Separate plasma from whole blood |
| Homogenization tubes | MP Biomedicals | SKU: 115076200-CF | Homogenization of vitreous |
| Homogenization caps | MP Biomedicals | SKU: 115063002-CF | Homogenization of vitreous |
| Glass beads | MP Biomedicals | SKU: 116914801 | Homogenization of vitreous |
| Homogeniser | Bertin Instruments | P000673-MLYS0-A | Homogenization of vitreous |
| 96-well plate – Transparent | Grenier | GN655101 | Protein quantification |
| Plate reader | Molecular devices | SpectrMax M4 | Absorbance measurement |
| Centrifuge | REMI | CPR240 Plus | Centrifugation |
| Fluorescence Angiography | |||
| Reagents | |||
| Isoflurane | Abbott | B506 | Anesthesia |
| FITC-dextran 70 kD (FITC, Dextran, Dibutylin dilaurate, DMSO | FITC, Dextran and Dibutylin dilaurate from Sigma; DMSO from HiMedia | FITC-F3651,Dextran-31390,Dibutylin dilaurate -29123, DMSO-TC185 | Prepared in-house |
| Fluoroshied | Sigma | F6182 | Anti-fading mounting medium |
| Equipments | |||
| Corneal forcep | Stephens Instruments | S5-1200 | Dissection |
| Colibri forcep | Stephens Instruments | S5-1135 | Dissection |
| Curved micro scissor | Stephens Instruments | S7-1311 | Dissection |
| Vannas scissor | Stephens Instruments | S7-1387 | Dissection |
| Iris scissor | Stephens Instruments | S7-1015 | Dissection |
| Glassware | Borosil | Not applicable | |
| Slides | HiMedia | BG005 | Flatmount preparation |
| Coverslips | HiMedia | BG014C | To cover tissue after adding mounting media |
| Confocal microscope | Leica | DMi8 | Visualization of flatmount |
References
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