고정화된 트로포미오신 키나제 수용체 B와 상호작용하는 특수 식물 대사산물을 확인하기 위한 세포막 친화성 크로마토그래피 컬럼
Summary
상기 프로토콜은 기능적 막횡단 트로포미오신 키나제 수용체 B 단백질을 함유하는 고정화된 세포막 단편을 갖는 세포막 친화성 크로마토그래피(CMAC) 컬럼의 제조를 기술한다. 이러한 수용체와 상호 작용하고 복잡한 천연 혼합물에 존재하는 특수 식물 대사 산물의 확인에 CMAC 컬럼의 사용도 설명됩니다.
Abstract
식물, 곰팡이, 박테리아 및 해양 무척추 동물에 의해 합성 된 화학 물질은 신약 히트 및 리드의 풍부한 원천이었습니다. 스타틴, 페니실린, 파클리탁셀, 라파마이신 또는 아르테미시닌과 같은 의약품은 의료 행위에서 일반적으로 사용되며 천연 제품에서 먼저 확인되고 분리되었습니다. 그러나 생물학적 활성 특수 대사 산물을 천연 공급원으로부터 식별하고 분리하는 것은 어렵고 시간이 많이 걸리는 과정입니다. 전통적으로, 개별 대사 산물은 바이오 매스의 추출에 따라 복잡한 혼합물로부터 분리되고 정제됩니다. 이어서, 단리된 분자는 그들의 생물학적 활성을 검증하기 위해 기능적 분석에서 시험된다. 여기서 우리는 복잡한 혼합물로부터 직접 생물학적 활성 화합물을 확인하기 위해 세포막 친화성 크로마토그래피 (CMAC) 컬럼의 사용을 제시한다. CMAC 컬럼은 천연 인지질 이중층 환경에 내재된 고정화된 기능성 막횡단 단백질(TMP)과 상호작용하는 화합물의 동정을 가능하게 한다. 이것은 표적화 된 접근법이며, 이는 새로 확인 된 소분자 약물 후보로 조절하려는 활성을 가진 TMP를 알아야합니다. 이 프로토콜에서, 우리는 수많은 신경계 장애에 대한 약물 발견의 실행 가능한 표적으로 부상 한 고정화 된 트로포미오신 키나제 수용체 B (TrkB)로 CMAC 컬럼을 제조하는 접근법을 제시합니다. 이 기사에서는 TrkB 수용체를 과발현하는 신경 모세포종 세포주를 사용하여 고정화 된 TrkB 수용체로 CMAC 컬럼을 조립하는 상세한 프로토콜을 제공합니다. 우리는 또한 컬럼의 기능을 조사하기위한 접근법과 TrkB 수용체와 상호 작용하는 특수 식물 대사 산물의 확인에 그 사용을 제시합니다.
Introduction
식물 혼합물은 약리학적 활성 화합물1이 풍부하여 신약 히트의 식별을 위한 좋은 공급원 으로 작용하며 2,3,4,5를 리드한다. 천연 제품에서 새로운 의약품을 발견하는 것은 유익한 접근 방식이었으며 현재 승인 된 많은 약물은 자연에서 처음 확인 된 화합물에서 유래했습니다. 천연 화합물의 화학적 다양성은 화학적으로 합성 된 분자의 인공 라이브러리와 일치하기가 어렵습니다. 많은 천연 화합물이 인간 단백질 표적과 상호작용하고 조절하며, 진화적으로 최적화된 약물-유사 분자6로 간주될 수 있다. 이들 천연 화합물은 신경 장애6에 사용하기 위한 약물 납 확인에 특히 매우 적합하다. 알츠하이머 병 (AD)의 관리를위한 현재 FDA 승인 약물 중 두 가지는 천연 알칼로이드, 즉 갈란 타민과 리바 스티그민 (피소스티그민의 유도체)6에서 파생됩니다. 현재 파킨슨 병에 가장 일반적으로 처방되는 약물 인 L-DOPA는 넓은 콩 (Vicia faba L)에서 처음 확인되었습니다. 7. Pergolide 및 lisuride, dopaminergic 수용체 작용제는 기생 균류 Claviceps purpurea8에서 천연 ergot alkaloids의 유도체입니다. Reserpine, 인도 뱀 뿌리 (Rauvolfia serpentina (L.) Benth. ex Kurz)에서 분리 된 알칼로이드는 최초의 항 정신병 약물중 하나였습니다 9. 최근에, 조절되지 않는 면역 반응 및 전신 염증은 다수의 신경학적 질환, 예컨대 주요 우울 장애 또는 신경퇴행성 질환(10)의 발달과 연결되었다. 다른 생활 습관 개입과 함께 식물 기반식이 요법은 노인의인지 능력 및 기능 능력을 향상시키는 것으로 밝혀졌습니다 11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21 . 트리테르펜 및 폴리페놀에 속하는 특정 친전자성 분자는 시험관내 및 생체내 모델12 모두에서 염증 반응을 조절하는 것으로 밝혀졌다. 예를 들어, α,β-불포화 카르보닐 (예를 들어, 커큐민, 신남알데히드), 또는 이소티오시아네이트 기 (예를 들어, 설포라판)를 함유하는 천연 화합물은 뮤린 인터루킨-3 의존성 pro-B 세포주12,22에서 전염증성 사이토카인의 하류 합성을 억제하는 톨-유사 수용체-4 (TLR4) 이량체화를 방해한다. . 역학적 증거는 복잡한 식품 매트릭스에 존재하는식이 식물 화학 물질이 또한 신약 리드의 실행 가능한 원천이 될 수 있음을 강력하게 지적합니다6.
식물 기반 식품을 포함한 식물 추출물에 존재하는 생물학적 활성 분자의 확인에 있어 주요 장애물 중 하나는 조사된 샘플의 복잡성이다. 전통적으로, 개별 화합물은 단리되고, 정제되고, 이어서 생물학적 활성에 대해 시험된다. 이러한 접근법은 일반적으로 가장 풍부하고 잘 특성화된 화합물의 확인으로 이어진다. 정의된 분자 표적이 없는 표현형 약물 발견 접근법은 복합 혼합물(23)의 생체가이드-분획화에 의존한다. 이 접근법에서, 추출물은 표현형 분석에서 후속적으로 시험되는 덜 복잡한 하위분획으로 분획된다. 활성 화합물의 단리 및 정제는 분석에서 검증된 생물학적 활성에 의해 유도된다. 특정 약물 표적의 동일성에 대한 지식은 복합 혼합물에 존재하는 약리학적 활성 화합물의 식별을 상당히 가속화시킬 수 있다. 이러한 접근법은 일반적으로 자성 비드(23)와 같은 고체 표면 상에 분자 표적, 예를 들어, 효소의 고정화에 기초한다. 고정화된 표적은 후속적으로 스크리닝 실험에 사용되어 표적과 상호작용하는 화합물의 단리를 초래한다. 이 접근법은 세포질 단백질을 표적으로 하는 화합물의 확인에 광범위하게 사용되었지만, 막횡단 단백질(TMPs)23과 상호작용하는 화학물질의 확인에는 덜 일반적으로 적용되어 왔다. TMPs의 고정화에 있어서의 추가적인 도전은 단백질의 활성이 세포막 인지질 및 콜레스테롤23,24와 같은 이중층의 다른 분자와의 상호작용에 의존한다는 사실로부터 기인한다. 막횡단 표적을 고정화하려고 할 때 단백질과 그들의 천연 인지질 이중층 환경 사이의 이러한 미묘한 상호작용을 보존하는 것이 중요하다.
세포막 친화성 크로마토그래피 (CMAC)에서 세포막 단편은 정제되지 않은 단백질이며, 인공 막 (IAM) 고정상 입자 (23) 상에 고정화된다. IAM 고정상은 포스파티딜콜린 유사체를 실리카 상에 공유 결합시킴으로써 제조된다. 최근 자유 아민 및 실라놀 그룹이 엔드 캡핑되는 IAM 고정상의 새로운 클래스가 개발되었습니다 (IAM. 개인용 컴퓨터. DD2 입자). CMAC 컬럼 준비 동안 세포막 단편은 흡착을 통해 IAM 입자의 표면 상에 고정화된다.
CMAC 컬럼은 현재까지 이온 채널 (예를 들어, 니코틴 수용체), GPCR (예를 들어, 오피오이드 수용체), 단백질 수송체 (예를 들어, p-당단백질) 등을 포함하는 TMP의 상이한 부류를 고정화하기 위해 사용되어 왔다.24. 고정화된 단백질 표적은 표적과 상호작용하는 소분자 리간드의 약력학(예를 들어, 해리 상수, Kd) 또는 결합 동역학(kon 및koff)의 결정뿐만 아니라 복합 매트릭스(24)에 존재하는 잠재적인 신약 리드의 동정 과정에서 사용되어 왔다. . 여기서 우리는 수많은 신경계 장애에 대한 약물 발견의 실행 가능한 표적으로 부상 한 고정화 된 트로포미오신 키나제 수용체 B (TrkB)를 가진 CMAC 컬럼의 제조를 제시합니다.
이전의 연구에 따르면 뇌 유래 신경 영양 인자 (BDNF) / TrkB 경로의 활성화는 AD 또는 주요 우울 장애 25,26,27,28과 같은 특정 신경 질환의 개선과 관련이 있음을 보여주었습니다. BDNF 수준 및 이의 수용체 TrkB 발현이 AD에서 감소하고, 유사한 감소가 AD29의 동물 모델에서 해마 기능을 손상시킨다는 것이 보고되었다. BDNF의 감소된 수준은 AD 환자30,31,32의 혈청 및 뇌에서 보고되었다. 타우 과발현 또는 과인산화는 원발성 뉴런 및 AD 동물 모델33,34,35에서 BDNF 발현을 하향 조절하는 것으로 밝혀졌다. 추가적으로, BDNF는 시험관내 및 생체내36에서 β-아밀로이드 유도된 신경독성에 대한 보호 효과를 갖는 것으로 보고되었다. 래트 뇌 내로의 BDNF의 직접 투여는 인지적으로 손상된 동물(37)에서 학습 및 기억력을 증가시키는 것으로 나타났다. BDNF / TrkB는 AD28,38을 포함한 신경 및 정신 질환을 개선하기위한 유효한 대상으로 나타났습니다. AD에서 치료법 개발을 위한 BDNF/TrkB 신호전달 경로를 표적화하는 것은 잠재적으로 질병(39)에 대한 우리의 이해를 향상시킬 것이다. 불행히도, BDNF 자체는 열악한 약동학 특성 및 부작용40 때문에 치료제로 사용할 수 없습니다. TrkB/BDNF 경로의 소분자 활성화제는 잠재적인 TrkB 리간드 41,42,43으로서 탐구되었다. 시험된 소분자 작용제 중에서, 7,8-디하이드록시플라본(7,8-DHF)은 BDNF/TrkB 경로41,44,45,46을 활성화시키는 것으로 나타났다. 7,8-DHF의 유도체 (R13; 4-옥소-2-페닐-4H-크로멘-7,8-디일 비스(메틸카바메이트))는 현재 AD47에 대한 가능한 약물로서 고려되고 있다. 최근에, 몇몇 항우울제가 TrkB에 직접 결합하고 BDNF 신호전달을 촉진함으로써 작용한다는 것이 밝혀졌으며, 다양한 신경 장애를 치료하기 위한 유효한 표적으로서 TrkB를 추구하는 것의 중요성을 더욱 강조하였다(48).
이 프로토콜은 기능적 TrkB 컬럼 및 TrkB-NULL 음성 대조군 컬럼을 조립하는 과정을 기술한다. 컬럼은 공지된 천연 생성물 소분자 리간드: 7,8-DHF를 사용하여 특성화된다. 추가적으로, 우리는 TrkB와 상호작용하는 화합물의 동정을 위해 식물 추출물을 예로 사용하여 복합 매트릭스를 스크리닝하는 과정을 설명한다.
Protocol
Representative Results
Discussion
특수 대사 산물의 복잡한 혼합물에 존재하는 활성 화합물의 확인은 매우 어려운 과제입니다23. 전통적으로, 개별 화합물은 단리되고, 그들의 활성은 상이한 검정에서 시험된다. 이러한 접근법은 시간이 많이 걸리고 비용이 많이 들며, 종종 가장 풍부하고 잘 특성화된 화합물(23)의 분리 및 동정으로 이어진다. 현재 사용되는 고처리량 스크리닝 분석은 이미 알려…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Z.C.A.는 터키 과학 기술 연구위원회 (TUBITAK) 2219- 국제 박사후 연구 펠로우십 프로그램의 지원을 받았습니다. 이 간행물에보고 된 연구는 수상 번호 1R41AT011716-01로 국립 보건원 (National Institutes of Health)의 무료 및 통합 의학 센터 (National Center for Complimentary and Integrative Medicine)의 지원을 받았다. 이 연구는 또한 미국 약리학 연구 스타터 그랜트 (American Society of Pharmacognosy Research Starter Grant), Regis Technologies 보조금 (Regis Technologies)이 L.C.에 부분적으로 지원했습니다. 내용은 전적으로 저자의 책임이며 반드시 국립 보건원 (National Institutes of Health)의 공식 견해를 나타내는 것은 아닙니다.
Materials
| 7-8 Dihydroxyflavone hydrate | Sigma-Aldrich | D5446-10 mg | ≥98% (HPLC) |
| Adenosine 5'-triphosphate (ATP) disodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | A2383-1 g | |
| Ammonium acetate | VWR Chemicals BDH | BDH9204-500 g | |
| BDNF antibody | Invitrogen | PA5-15198-400 μL | Primary antibody; 2 mg/mL of concentration |
| Benzamidine hydrochloride hydrate | Sigma-Aldrich | B6506-25 g | |
| Brain derived neurotrophic factor (BDNF) human | Sigma-Aldrich | B3795-10 μg | Recombinant, expressed in E. coli, lyophilized powder, suitable for cell culture |
| Calcium chloride | VWR Analytical | BDH9224-1 kg | |
| Cholic acid sodium salt | Alfa Aesar | J62050-100 g | |
| Dounce homogenizer | VWR | 71000-516 | 40 mL, 285 mm (overall lenght), 32 x 140 mm (O.D. x H) |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | 493511 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | VWR Analytical | BDH-9232-500 g | |
| Fetal bovine serum | Sigma-Aldrich | F2442-500 mL | sterile-filtered, suitable for cell culture |
| G418 disulfate salt solution | Sigma-Aldrich | G8168-100 mL | 50 mg/mL in H2O, 0.1 μm filtered, suitable for cell culture |
| Glycerol | VWR Life Science | E520-100 mL | |
| Immobilized artificial membrane (IAM.PC.DD2) | Regis Technologies, Inc. | 1-771050-500 | |
| Magnesium chloride hexahydrate | VWR Analytical | BDH9244-500 mL | |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 322425 | |
| Nikon Plan Fluor | Nikon | Confocal laser scanning microscope | |
| Normal goat serum (10%) | Life Technologies | 50197Z | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333-100 mL | |
| Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) | Thermo Scientific | 36978-5 g | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | VWR Life Science | K812-500 mL | 1x |
| Potassium chloride | VWR Chemicals BDH | 0395-1 kg | |
| Protease inhibitor cocktail | VWR Life Science Ambreso | M221-1 mL | Proteomics grade, containing 50 mM AEBSF, 30 µM aprotonin, 1 mM bestatin, 1 mM E-64 and 1 mM leupeptin |
| RPMI-1640 medium | Sigma-Aldrich | R8758-500 mL | with L-glutamine and sodium bicarbonate, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture |
| Secondary antibody goat anti-rabbit IgG (H+L) | Invitrogen Alexa Flour Plus 488 | A32731 | |
| SH-SY5Y Neuroblastoma cell lines expressing Trk-B | Kerafast | ECP007 | |
| SH-SY5Y Trk-NULL cell line | Kerafast | ECP005 | |
| Snake skin dialysis tubing | Thermo Scientific | 88245 | 10K MWCO, 35 mm dry I.D. |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002 | |
| Sodium chloride | BDH VWR Analytical | BDH9286-2.5 kg | |
| Tricorn 5/20 column | GE Healthcare | 24-4064-08 | |
| Tris-HCl | VWR Life Science | 0497-1 kg | |
| Trypsin-EDTA solution | Sigma-Aldrich | T4049-500 mL | 0.25%, sterile-filtered, suitable for cell culture, 2.5 g porcine trypsin and 0.2 g EDTA |
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