Tek Hücreli Multi-Omik Deneyler için Fare Karotis Arterlerinin Lümeninden Endotel Hücrelerinin İzolasyonu
Summary
Tek hücreli omik deneyler yapmak için stabil veya rahatsız edici akış koşullarına maruz kalan fare karotis arterlerinin lümeninden endotel hücrelerini ve çekirdeklerini izole etmek için bir yöntem sunuyoruz.
Abstract
Ateroskleroz, bozulmuş kan akışına (d-flow) maruz kalan arteriyel bölgelerin enflamatuar bir hastalığıdır. D-akımı , endoteldeki genlerin ekspresyonunu transkriptomik ve epigenomik seviyelerde düzenler ve proaterojenik yanıtlarla sonuçlanır. Son zamanlarda, fare kısmi karotis ligasyonu (PCL) modeli kullanılarak transkriptomik ve kromatin erişilebilirliği değişikliklerini tek hücreli çözünürlükte belirlemek için Transpozaz Erişilebilir Kromatin dizilimi (scATACseq) için tek hücreli RNA dizilimi (scRNAseq) ve tek hücreli Tahlil çalışmaları yapılmıştır. Endotel hücreleri (ECs), arter duvarındaki toplam hücre popülasyonlarının küçük bir kısmını temsil ettiğinden, EC ile zenginleştirilmiş tek hücreli preparatlar elde etmek için luminal bir sindirim yöntemi kullanılmıştır. Bu çalışma için fareler, sağ karotis arteri (RCA) kontrol olarak kullanırken, sol karotis arterde (LCA) d-akışını indüklemek için PCL cerrahisine tabi tutuldu. Karotis arterler PCL cerrahisinden iki gün veya iki hafta sonra diseke edildi. Her karotidin lümeni kollajenaz sindirimine tabi tutuldu ve endotelyal zenginleştirilmiş tek hücreler veya tek çekirdekler elde edildi. Bu tek hücreli ve tek çekirdekli preparatlar daha sonra 10x Genomik mikroakışkan kurulum kullanılarak barkodlandı. Barkodlanmış tek hücreler ve tek çekirdekler daha sonra RNA hazırlama, kütüphane oluşturma ve yüksek verimli bir DNA sıralayıcısında dizileme için kullanıldı. Biyoinformatik işleme sonrası, scRNAseq ve scATACseq veri kümeleri, öncelikle EC’lerden oluşan luminal sindirimden çeşitli hücre tiplerini tanımladı. Düz kas hücreleri, fibroblastlar ve bağışıklık hücreleri de mevcuttu. Bu EC-zenginleştirme yöntemi, toplam arter sindirim yöntemiyle zor olabilecek kan akışının endotel üzerindeki etkisini anlamaya yardımcı oldu. EC ile zenginleştirilmiş tek hücreli hazırlama yöntemi, kan akışının bu genler üzerindeki etkisinin çalışılmadığı EC-nakavtlarda ve transgenik farelerde tek hücreli omik çalışmalar yapmak için kullanılabilir. Önemli olarak, bu teknik, benzer mekanik çalışmalar yapmak için EC ile zenginleştirilmiş tek hücreleri insan arter eksplantlarından izole etmek için uyarlanabilir.
Introduction
Bu laboratuvar daha önce d-flow indüksiyonunun hiperlipidemik farelerde hızlı ve sağlam ateroskleroz gelişimine yol açtığını göstermiştir 1,2. D-flow kaynaklı aterosklerozun yeni fare modeli, kısmi karotis ligasyonu (PCL) cerrahisi kullanılarak mümkün olmuştur 3. PCL cerrahisi, bağlı sol karotis arterde (LCA) düşük ve salınımlı kan akımı durumunu veya d-akışını indükler. Buna karşılık, kontralateral sağ karotis arter (RCA) stabil laminer akışla (s-flow) yüzleşmeye devam eder. Önceden, d-akışının endotel hücreleri üzerindeki etkisini anlamak için, karotis arterler kısmi ligasyon ameliyatından sonra diseke edildi ve endotelyal olarak zenginleştirilmiş “havuzlanmış yığın” RNA’ları veya DNA’ları sağlayan bir fenol ve guanidin izotiyosiyanat bazlı lize edici ajan (luminal RNA / DNA yıkama yöntemi)2,4 ile yıkandı. Bu havuzlanmış toplu RNA’lar veya DNA’lar daha sonra sırasıylatranskriptomik çalışmalar veya epigenomik DNA metilom çalışmaları için işlendi, sırasıyla 4,5,6. Bu çalışmalar, endotel biyolojisi ve aterosklerozdaki rolleri kapsamlı bir şekilde araştırılan çoklu akışa duyarlı genlerin ve mikroRNA’ların keşfedilmesine yardımcı oldu 4,6,7.
Bununla birlikte, endotel zenginleştirmesine rağmen, bu toplu RNA / DNA çalışmaları, d-flow kaynaklı aterosklerozda arter duvarındaki her hücre tipinin spesifik rolünü ayırt edememiştir. Bu sınırlılığın üstesinden gelmek için endotelyal zenginleştirilmiş tek hücreli (sc) izolasyon ve scRNA ve scATAC dizileme çalışmalarıyapılmıştır 8. Bunun için, C57Bl6 fareleri, s-akışına maruz kalan RCA’yı kontrol olarak kullanırken LCA’da d-akışını indüklemek için PCL ameliyatına tabi tutuldu. PCL ameliyatından iki gün veya iki hafta sonra, fareler kurban edildi ve karotidler diseke edildi ve temizlendi. Hem LCA’ların hem de RCA’ların lümenleri kollajenaz ile aşılandı ve önemli bir fraksiyon olarak ECs içeren luminal kollajenaz sindirimi ve diğer arteriyel hücreler toplandı. Tek hücreli süspansiyon (scRNAseq) veya tek çekirdekli süspansiyon (scATACseq), 10x Genomik kurulum kullanılarak her hücre veya çekirdek için benzersiz tanımlayıcılarla hazırlandı ve barkodlandı. RNA’lar cDNA kütüphanesi hazırlığına tabi tutuldu ve sıralandı.
scRNAseq ve scATACseq veri kümeleri, Cell Ranger Tek Hücreli Yazılım kullanılarak işlendi ve ayrıca Seurat ve Signac R paketleri 9,10 tarafından analiz edildi. Her hücreye ve çekirdeğe bu analizlerden bir hücre tipi atandı ve işaretleyici genlere ve benzersiz gen ekspresyon modellerine dayanarak hücre tipine kümelendi. ScRNAseq ve scATACseq’in sonuçları, bu tek hücreli preparatların ECs ile zenginleştirildiğini ve ayrıca düz kas hücreleri (SMC’ler), fibroblastlar ve bağışıklık hücreleri içerdiğini göstermiştir.
Daha ileri analizler, luminal sindirimdeki EC popülasyonunun oldukça farklı ve plastik (8 farklı EC kümesi) olduğunu ve kan akışına duyarlı olduğunu ortaya koymuştur. En önemlisi, bu sonuçlar d-flow’un ECs’leri athero korumalı bir anti-enflamatuar fenotipten, pro-enflamatuar, endotelyal-mezenkimal geçiş, endotel kök / progenitör hücre geçişi ve en şaşırtıcı şekilde, endotelyal-bağışıklık hücresi benzeri geçiş dahil olmak üzere pro-aterojenik fenotiplere yeniden programladığını göstermiştir. Ek olarak, scATACseq verileri, birkaç yeni hipotezin temelini oluşturan genom çapında yeni akışa bağlı kromatin erişilebilirlik değişikliklerini ve transkripsiyon faktörü bağlanma bölgelerini ortaya koymaktadır. Fare karotis arterlerinden tek hücreli multi-omik çalışmalar için tek endotel hücrelerinin hazırlanmasına yönelik metodoloji ve protokol aşağıda detaylandırılmıştır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu yazıda, tek hücreli preparatları fare karotis arterlerinden izole etmek için ayrıntılı bir protokol sunulmaktadır. D-flow’un endotel hücreleri üzerindeki etkisi, PCL cerrahisi doğru bir şekilde gerçekleştirilirse doğru bir şekilde incelenebilir. Dış karotid, internal karotid, oksipital arter ve superior tiroid arter gibi ortak karotidin dallarını doğru bir şekilde tanımlamak çok önemlidir. Ultrasonografi ile akış paternlerinin doğrulanması, d-flow koşullarının başarı…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma, Ulusal Sağlık Enstitüleri HL119798, HL095070 ve HL139757’den HJ’ye hibe edilen fonlarla desteklenmiştir. HJ ayrıca Wallace H. Coulter Seçkin Fakülte Başkanı Profesörlüğü tarafından da desteklenmektedir. Emory Entegre Genomik Çekirdeği (EIGC) tarafından sağlanan hizmetler, Emory Üniversitesi Tıp Fakültesi tarafından sübvanse edildi ve ayrıca Ulusal Sağlık Enstitüleri’nin Georgia Klinik ve Translasyonel Bilim İttifakı tarafından ödül numarası altında kısmen desteklendi. UL1TR002378. Yukarıda verilen içerik yalnızca yazarların sorumluluğundadır ve Ulusal Sağlık Enstitüleri’nin resmi görüşlerini yansıtmamaktadır.
Materials
| Chemicals, Peptides, and Recombinant Proteins | |||
| 1x PBS (Cell Culture Grade) | Corning | 21040CMX12 | |
| 1.5 mL Protein LoBind Microcentrifuge Tubes | Eppendorf | 022-43-108-1 | |
| 15 mL Centrifuge Tube – Foam Rack, Sterile | Fablab | FL4022 | |
| 50 mL SuperClear Centrifuge Tubes | Labcon | 3191-335-028 | |
| 6-0 Silk Suture Sterile | Covidien | s-1172 c2 | |
| 70 µm Cell Strainer, White, Sterile, Individually Packaged | Thermo Fisher Scientic | 08-771-2 | |
| Accutase solution,sterile-filtered | Sigma-Aldrich | A6964-100ML | or equivalent |
| ATAC Buffer (Component I of Transposition Mix) | 10x Genomics | 2000122 | |
| ATAC Enzyme (Component II of Transposition Mix) | 10x Genomics | 2000123/ 2000138 | |
| Bovine Serum albumin | Sigma-Aldrich | A7906-500G | |
| Buprenorphine | Med-Vet International | RXBUPRENOR5-V | |
| Chromium Controller & Next GEM Accessory Kit | 10X Genomics | 1000204 | |
| Chromium Next GEM Single Cell 3' Reagent Kits v3.1 | 10X Genomics | 1000121 | |
| Chromium Next GEM Single Cell ATAC Reagent Kits v1.1 | 10X Genomics | 1000175 | |
| Collagenase II | MP Biomedicals | 2100502.5 | |
| Digitonin | Sigma-Aldrich | D141-100MG | |
| Dissecting Forceps | Roboz Surgical Instruments Co | RS-5005 | |
| Dnase1 | New England Biolabs Inc | M0303S | |
| Centrifuge (Benchtop-Model # 5425) | Eppendorf | 22620444230VR | |
| Fetal Bovine Serum – Premium Select | R&D systems | S11550 | |
| Fixed Angle Rotor | Eppendorf | FA-45-24-11-Kit Rotor | |
| HEPES buffered saline | Millipore Sigma | 51558 | |
| Insulin syringe (3/10 mL 29 G syringe) | BD | 305932 | |
| Isoflurane | Patterson vet | 789 313 89 | |
| MACs Smart Strainers (30 µm) | Miltenyi Biotec | 130-098-458 | |
| MACS SmartStrainers (100 µm) | Miltenyi Biotec | 130-098-463 | |
| Normal Saline (0.9% sodium chloride) | Baxter International Inc | 2B1323 | |
| Nuclei Buffer (20x) | 10x Genomics | PN 2000153/2000207 | |
| PBS (10x), pH 7.4 | Thermo Fisher Scientic | 70011-044 | |
| Small scissors | Roboz Surgical Instruments Co | RS-5675 | |
| Stainless Steel Micro Clip Applying Forceps With Lock | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5480 | or similar |
| Tissue Mend II | Webster Veteinanry | 07-856-7946 | |
| Type II Collagenase | MP biomedicals | 2100502.1 | |
| Deposited Data | |||
| scATACseq FastQ files | NCBI | www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject Accession # PRJNA646233 | |
| scRNAseq FastQ files | NCBI | www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject Accession # PRJNA646233 | |
| Software and Algorithms | |||
| Cell Ranger 3.1.0 | 10X Genomics | https://support.10xgenomics.com/ single-cell-gene-exp | |
| Cicero | Pliner et al., 2018 | https://cole-trapnell-lab.github.io/cicero-release/ | |
| Ggplot2 v3.2.1 | Hadley Wickham | https://cran.r-project.org | |
| Harmony | Korsunsky et al., 2019 | https://github.com/immunogenomics/harmony | |
| ImageJ | Schneider et al., 2012 | https://imagej.nih.gov | |
| Monocle 2.8.0 | Qiu et al., 2017 | https://github.com/cole-trapnell-lab/ monocle-release | |
| R version 3.6.2 | R Foundation | https://www.r-project.org | |
| Seurat 3.1.3 | Stuart et al., 2019 | https://github.com/satijalab/seurat | |
| Signac 0.2.5 | Stuart et al., 2019 | https://github.com/timoast/signac |
References
- Kumar, S., Kang, D. W., Rezvan, A., Jo, H. Accelerated atherosclerosis development in C57Bl6 mice by overexpressing AAV-mediated PCSK9 and partial carotid ligation. Laboratory Investigation. 97 (8), 935-945 (2017).
- Nam, D., et al. Partial carotid ligation is a model of acutely induced disturbed flow, leading to rapid endothelial dysfunction and atherosclerosis. American Journal of Physiology Heart and Circulation Physiology. 297 (4), 1535-1543 (2009).
- Nam, D., et al. A model of disturbed flow-induced atherosclerosis in mouse carotid artery by partial ligation and a simple method of RNA isolation from carotid endothelium. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (40), e1861 (2010).
- Dunn, J., et al. Flow-dependent epigenetic DNA methylation regulates endothelial gene expression and atherosclerosis. Journal of Clinical Investigation. 124 (7), 3187-3199 (2014).
- Kumar, S., Kim, C. W., Son, D. J., Ni, C. W., Jo, H. Flow-dependent regulation of genome-wide mRNA and microRNA expression in endothelial cells in vivo. Scientific Data. 1 (1), 140039 (2014).
- Ni, C. W., et al. Discovery of novel mechanosensitive genes in vivo using mouse carotid artery endothelium exposed to disturbed flow. Blood. 116 (15), 66-73 (2010).
- Son, D. J., et al. The atypical mechanosensitive microRNA-712 derived from pre-ribosomal RNA induces endothelial inflammation and atherosclerosis. Nature Communications. 4, 3000 (2013).
- Andueza, A., et al. Endothelial reprogramming by disturbed flow revealed by single-cell RNA and chromatin accessibility study. Cell Reports. 33 (11), 108491 (2020).
- Stuart, T., Srivastava, A., Lareau, C., Satija, R. Multimodal single-cell chromatin analysis with Signac. bioRxiv. , (2020).
- Stuart, T., et al. Comprehensive integration of single-cell data. Cell. 177 (7), 1888-1902 (2019).
- Crowley, L. C., Marfell, B. J., Christensen, M. E., Waterhouse, N. J. Measuring cell death by trypan blue uptake and light microscopy. Cold Spring Harbor Protocols. 2016 (7), (2016).
- Li, F., et al. Single-cell RNA-seq reveals cellular heterogeneity of mouse carotid artery under disturbed flow. Cell Death and Discovery. 7 (1), 180 (2021).
- Wu, Y. E., Pan, L., Zuo, Y., Li, X., Hong, W. Detecting activated cell populations using single-cell RNA-seq. Neuron. 96 (2), 313-329 (2017).
- O’Flanagan, C. H., et al. Dissociation of solid tumor tissues with cold active protease for single-cell RNA-seq minimizes conserved collagenase-associated stress responses. Genome Biology. 20 (1), 210 (2019).
