Patroonvorming van micro-organismen en microdeeltjes door sequentiële capillariteitsondersteunde assemblage
Summary
We presenteren een technologie die capillariteitsondersteunde assemblage in een microfluïdisch platform gebruikt om microgrote objecten die in een vloeistof zijn gesuspendeerd, zoals bacteriën en colloïden, te modelleren in voorgeschreven arrays op een polydimethylsiloxaansubstraat.
Abstract
Gecontroleerde patronen van micro-organismen in gedefinieerde ruimtelijke arrangementen bieden unieke mogelijkheden voor een breed scala aan biologische toepassingen, waaronder studies van microbiële fysiologie en interacties. Op het eenvoudigste niveau zou nauwkeurige ruimtelijke patroonvorming van micro-organismen betrouwbare, langdurige beeldvorming van grote aantallen individuele cellen mogelijk maken en het vermogen transformeren om afstandsafhankelijke microbe-microbe-interacties kwantitatief te bestuderen. Meer uniek is dat het koppelen van nauwkeurige ruimtelijke patronen en volledige controle over omgevingsomstandigheden, zoals aangeboden door microfluïdische technologie, een krachtig en veelzijdig platform zou bieden voor eencellige studies in microbiële ecologie.
Dit artikel presenteert een microfluïdisch platform om veelzijdige en door de gebruiker gedefinieerde patronen van micro-organismen te produceren binnen een microfluïdisch kanaal, waardoor volledige optische toegang mogelijk is voor langdurige monitoring met hoge doorvoer. Deze nieuwe microfluïdische technologie is gebaseerd op capillariteitsondersteunde deeltjesassemblage en maakt gebruik van de capillaire krachten die voortvloeien uit de gecontroleerde beweging van een verdampende suspensie in een microfluïdisch kanaal om individuele microsized objecten af te zetten in een reeks vallen die microgefabriceerd zijn op een polydimethylsiloxaan (PDMS) substraat. Sequentiële afzettingen genereren de gewenste ruimtelijke lay-out van enkele of meerdere soorten objecten op microformaat, uitsluitend gedicteerd door de geometrie van de vallen en de vulvolgorde.
Het platform is gekalibreerd met behulp van colloïdale deeltjes van verschillende afmetingen en materialen: het heeft bewezen een krachtig hulpmiddel te zijn om diverse colloïdale patronen te genereren en oppervlaktefunctionalisatie van gevangen deeltjes uit te voeren. Verder werd het platform getest op microbiële cellen, met Escherichia coli-cellen als modelbacterie. Duizenden individuele cellen werden op het oppervlak gemodelleerd en hun groei werd in de loop van de tijd gevolgd. In dit platform maakt de koppeling van eencellige depositie en microfluïdische technologie zowel geometrische patronen van micro-organismen als nauwkeurige controle van omgevingsomstandigheden mogelijk. Het opent dus een venster op de fysiologie van afzonderlijke microben en de ecologie van microbe-microbe interacties, zoals blijkt uit voorlopige experimenten.
Introduction
Ruimtelijke patronen van afzonderlijke micro-organismen, met name binnen experimentele arena’s die volledige controle over omgevingsomstandigheden mogelijk maken, zoals microfluïdische apparaten, is zeer wenselijk in een breed scala van contexten. Het rangschikken van micro-organismen in regelmatige arrays zou bijvoorbeeld de nauwkeurige beeldvorming van grote aantallen individuele cellen mogelijk maken en de studie van hun groei, fysiologie, genexpressie als reactie op omgevingsstimuli en gevoeligheid voor geneesmiddelen. Het zou ook het mogelijk maken om cel-celinteracties te bestuderen die van bijzonder belang zijn in onderzoek naar cellulaire communicatie (bijv. Quorum Sensing), kruisvoeding (bijv. Algen-bacteriële symbiose) of antagonisme (bijv. Allelopathie), met volledige controle over de ruimtelijke lokalisatie van cellen ten opzichte van elkaar. Celfysiologie en evolutiestudies1, cel-celinteractiestudies2, fenotypische differentiatiescreening3, omgevingsmonitoring4 en geneesmiddelenscreening5 behoren tot de gebieden die veel baat kunnen hebben bij een technologie die in staat is om een dergelijke kwantitatieve eencellige analyse te bereiken.
In de afgelopen jaren zijn verschillende strategieën voorgesteld om afzonderlijke cellen te isoleren en te hanteren, van holografische optische vallen6 en heterogene oppervlaktefunctionalisatiemethoden7,8,9,10 tot eencellige chemostaten11 en druppelmicrofluïdica12. Deze methoden zijn technisch zeer veeleisend of beïnvloeden de celfysiologie en bieden geen high-throughput platform voor patroonmicroben die gedurende lange perioden kunnen worden bestudeerd, waardoor eencellige resolutie, volledige optische toegang en controle over omgevingsomstandigheden worden gegarandeerd. Het doel van dit artikel is om een platform te beschrijven om bacteriën met micrometrische precisie te modelleren in voorgeschreven ruimtelijke arrangementen op een PDMS-oppervlak door middel van capillariteitsondersteunde assemblage. Dit platform maakt nauwkeurige en flexibele ruimtelijke patronen van microben mogelijk en maakt volledige optische toegang en controle over omgevingsomstandigheden mogelijk, dankzij het microfluïdische karakter.
De technologie achter dit platform is een assemblagetechnologie die de afgelopen jaren is ontwikkeld, genaamd sCAPA13,14,15 (sequentiële capillariteitsondersteunde deeltjesassemblage) die is geïntegreerd in een microfluïdisch platform16. De meniscus van een verdampende vloeistofdruppel, terwijl hij zich terugtrekt over een patroon polydimethylsiloxaan (PDMS) substraat in een microfluïdisch kanaal, oefent capillaire krachten uit die de individuele colloïdale deeltjes die in de vloeistof zijn gesuspendeerd, opvangen in micrometrische putten die op het substraat zijn gemicrofabriceerd (figuur 1A). Zwevende deeltjes worden eerst door convectieve stromen naar het lucht-vloeistof-grensvlak getransporteerd en vervolgens door capillariteit in de vallen geplaatst. Capillaire krachten die door de bewegende meniscus worden uitgeoefend, werken op grotere schaal in vergelijking met krachten die betrokken zijn bij deeltjesinteracties.
Het assemblagemechanisme wordt dus niet beïnvloed door het materiaal, de afmetingen en de oppervlakte-eigenschappen van de deeltjes. Parameters zoals deeltjesconcentratie, de snelheid van de meniscus, temperatuur en oppervlaktespanning van de suspensie zijn de enige parameters die de opbrengst van het patroonproces beïnvloeden. De lezer kan een gedetailleerde beschrijving vinden van de invloed van de bovengenoemde parameters op het patroonproces in13,14,15. In de oorspronkelijke sCAPA-technologie13,14,15 werd het colloïdale patroonproces uitgevoerd in een open systeem en vereiste een zeer nauwkeurige piëzo-elektrische trap om de ophanging over de sjabloon te drijven. Dit platform maakt gebruik van een andere strategie en maakt het mogelijk om de patronen uit te voeren met standaardapparatuur die over het algemeen wordt gebruikt in microfluïdica in een gecontroleerde omgeving, waardoor de risico’s van contaminatie van de monsters worden geminimaliseerd.
Dit microfluïdische platform werd eerst geoptimaliseerd op colloïdale deeltjes om regelmatige arrays van inerte deeltjes te creëren en vervolgens met succes toegepast op bacteriën. Beide microfluïdische platforms worden in dit artikel beschreven (figuur 1B,C). De meeste voorbereidende stappen en de experimentele apparatuur die in het protocol worden beschreven, zijn gemeenschappelijk voor de twee toepassingen (figuur 2). We rapporteren colloïdale patronen om aan te tonen dat de techniek kan worden gebruikt om meerdere sequentiële afzettingen op hetzelfde oppervlak uit te voeren om complexe, multimateriële patronen te creëren. In het bijzonder werd één enkel deeltje per val voor elke stap afgezet om colloïdale arrays te vormen met een specifieke geometrie en samenstelling, uitsluitend gedicteerd door de geometrie en vulvolgorde van de vallen. Wat bacteriële patronen betreft, worden enkele afzettingen beschreven, waardoor er één bacterie per val wordt afgezet. Zodra cellen op het oppervlak zijn gemodelleerd, wordt het microfluïdische kanaal gespoeld met medium om bacteriegroei te bevorderen, de voorbereidende stap van elke eencellige studie.
Protocol
Representative Results
Discussion
Het hier beschreven microfluïdische platform maakt het mogelijk om objecten van microformaat, zoals colloïden en bacteriën, in voorgeschreven ruimtelijke arrangementen op een PDMS-substraat te modelleren. De volledige controle over de omgevingsomstandigheden die microfluïdica biedt en de mogelijkheid om cellen met micrometrische precisie te modelleren die door sCAPA-technologie wordt verleend, maakt het een veelbelovend platform voor toekomstige fysiologie- en ecologiestudies.
In de experi…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs erkennen de steun van SNSF PRIMA-subsidie 179834 (aan E.S.), een ETH Research Grant ETH-15 17-1 (R. S.) en een Gordon and Betty Moore Foundation Investigator Award on Aquatic Microbial Symbiosis (grant GBMF9197) (R. S.). De auteurs bedanken Dr. Miguel Angel Fernandez-Rodriguez (Universiteit van Granada, Spanje) voor de SEM-beeldvorming van bacteriën en voor de inzichtelijke discussies. De auteurs bedanken Dr. Jen Nguyen (University of British Columbia, Canada), Dr. Laura Alvarez (ETH Zürich, Zwitserland), Cameron Boggon (ETH Zürich, Zwitserland) en Dr. Fabio Grillo voor de inzichtelijke discussies.
Materials
| Alcatel AMS 200SE I-Speeder | Alcatel Micro Machining System | deep reactive ion exchange system | |
| Alconox | detergent | ||
| AZ400K developer | MicroChemicals | AZ400K | |
| BD 10 mL Syringe (Luer-Lock) | BD | 300912 | used to flush fresh Lysogeny broth into the microfluidic channel |
| Box Incubator | Life Imaging Services | used to ensure a uniform and constant temperature in the channel | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5424R | used to replace the overnight media with fresh minimal media |
| Centrifuge vial | Eppendorf | 30120086 | 1.5 mL |
| CETONI Base 120 | CETONI GmbH | syringe pump | |
| Fluorescent PS particles of diameter 0.98 µm (red) | microParticles GmbH | PS-FluoRed-Fi267 | |
| Fluorescent PS particles of diameter 1.08 µm (green) | microParticles GmbH | PS-FluoGreen-Fi182 | |
| Fluorescent PS particles of diameter 2.07 µm (green) | microParticles GmbH | PS-FluoGreen-Fi183 | |
| Fluorescent PS particles of diameter 2.08 µm (red) | microParticles GmbH | PS-FluoRed-Fi180 | |
| Gigabatch 310 M | PVA TePla | used to plasma treat a 10 cm silicon wafer | |
| H401-T-CONTROLLER | Okolab | controller of the heated glass plate | |
| H601-NIKON-TS2R-GLASS | Okolab | heated glass plate | |
| Heidelberg DWL 2000 | Heidelberg Instruments | UV direct laser writer | |
| Insulin syringes, U 100, with luer | Codan Medical ApS | CODA621640 | 1 mL syringe used to withdraw the liquid suspension during the patterning process |
| Klayout | Opensource | used to design the features on the silicon master | |
| LB Broth, Miller (Luria-Bertani) | Fisher Scientific | 244610 | Lysogeny broth flushed into the microfluidic channel |
| Masterflex transfer tubing | Masterflex | HV-06419-05 | 0.020'' ID, 0.06'' OD |
| MOPS (10x) | Teknova | M2101 | diluted tenfold with milliQ water and used to replace the overnight medium |
| Nikon Eclipse Ti2 | Nikon Instruments | microscope | |
| openSCAD | Opensource | used to design the mold | |
| OPTIspin SB20 | ATM group | 51-0002-01-00 | spin developer |
| Plasma chamber Zepto | Diener Electronic | ZEPTO-1 | used to plasma treat the template and microchannel to bond them |
| Positive photoresist AZ1505 | MicroChemicals | AZ1505 | |
| Potassium phosphate dibasic | Sigma Aldrich | P3786 | added to MOPS 1x |
| Prusa curing and Washing machine CW1S | Prusa | used to ensure all polymer is cured and uncured polymer is removed from the mold | |
| Prusa Resin – Tough | Prusa Research a.s. | UV photosensitive 405nm liquid resin for 3D printing | |
| Prusa SL1 3d printer | Prusa | used to print the mold | |
| Scale | VWR-CH | 611-2605 | used to weight PDMS mixture |
| Silicon wafer (10 cm) | Silicon Materials Inc. | N/Phos <100> 1-10 Ω cm | |
| Süss MA6 Mask aligner | SUSS MicroTec Group | used to align the chrome-glass mask and the substrate, and expose the substrate | |
| Sylgard 184 | Dow Corning | silicone elastomer kit; curing agent | |
| Techni Etch Cr01 | Technic | chromium etchant | |
| Trichloro (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyl) silane | Sigma Aldrich | 448931 | used to silianize the 3D printed mold |
| TWEEN 20 | Sigma Aldrich | P1379 | used to ensure an optimal receding contact angle during the patterning process |
| Veeco Dektak 6 M | Veeco | profilometer | |
| VTC-100 Vacuum Spin Coater | MTI corporation | vacuum spin coater |
References
- Choi, C. H., et al. Preparation of bacteria microarray using selective patterning of polyelectrolyte multilayer and poly(ethylene glycol)-poly(lactide) deblock copolymer. Macromolecular Research. 18 (3), 254-259 (2010).
- Smriga, S., Fernandez, V. I., Mitchell, J. G., Stocker, R. Chemotaxis toward phytoplankton drives organic matter partitioning among marine bacteria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (6), 1576-1581 (2016).
- Thomas, C. M., Nielsen, K. M. Mechanisms of, and barriers to, horizontal gene transfer between bacteria. Nature Reviews Microbiology. 3 (9), 711-721 (2005).
- Suo, Z., Avci, R., Yang, X., Pascual, D. W. Efficient Immobilization and patterning of live bacterial cells. Langmuir. 24 (8), 4161-4167 (2008).
- Kane, B. J., Zinner, M. J., Yarmush, M. L., Toner, M. Liver-specific functional studies in a microfluidic array of primary mammalian hepatocytes. Analytical Chemistry. 78 (13), 4291-4298 (2006).
- Akselrod, G. M., et al. Laser-guided assembly of heterotypic three-dimensional living cell microarrays. Biophysical Journal. 91 (9), 3465-3473 (2006).
- Cerf, A., Cau, J. C., Vieu, C., Dague, E. Nanomechanical properties of dead or alive single-patterned bacteria. Langmuir. 25 (10), 5731-5736 (2009).
- Cerf, A., Cau, J. C., Vieu, C. Controlled assembly of bacteria on chemical patterns using soft lithography. Colloids and Surfaces: B Biointerfaces. 65 (2), 285-291 (2008).
- Rozhok, S., et al. Attachment of motile bacterial cells to prealigned holed microarrays. Langmuir. 22 (26), 11251-11254 (2006).
- Xu, L., et al. Microcontact printing of living bacteria arrays with cellular resolution. Nano Letters. 7 (7), 2068-2072 (2007).
- Ingham, C. J., et al. The micro-Petri dish, a million-well growth chip for the culture and high-throughput screening of microorganisms. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (46), 18217-18222 (2007).
- Moffitt, J. R., Lee, J. B., Cluzel, P. The single-cell chemostat: an agarose-based, microfluidic device for high-throughput, single-cell studies of bacteria and bacterial communities. Lab on a Chip. 12 (8), 1487-1494 (2012).
- Ni, S., Isa, L., Wolf, H. Capillary assembly as a tool for the heterogeneous integration of micro- and nanoscale objects. Soft Matter. 14 (16), 2978-2995 (2018).
- Ni, S., Leemann, J., Buttinoni, I., Isa, L., Wolf, H. Programmable colloidal molecules from sequential capillarity-assisted particle assembly. Science Advances. 2 (4), 1501779 (2016).
- Ni, S., Leemann, J., Wolf, H., Isa, L. Nanoparticle Insights into mechanisms of capillary assembly. Faraday Discussions. 181, 225-242 (2014).
- Pioli, R., et al. Sequential capillarity-assisted particle assembly in a microfluidic channel. Lab on a Chip. 21 (5), 888-895 (2021).
- Geissler, M., et al. Fabrication of metal nanowires using microcontact printing. Langmuir. 19 (15), 6301-6311 (2003).
- Wang, Y., et al. Systematic prevention of bubble formation and accumulation for long-term culture of pancreatic islet cells in microfluidic device. Biomedical Microdevices. 14 (2), 419-426 (2012).
- Crowley, L. C., et al. Measuring cell death by propidium iodide uptake and flow cytometry. Cold Spring Harbor Protocols. 7, 647-651 (2016).
