Eski Vivo Farede Portal Damarından Hepatik Perfüzyon
Summary
Protokol, portal ven perfüzyonu yoluyla metabolik çalışmalar için sağlam bir fare karaciğerini rezeke etmenin basit bir yöntemini açıklar.
Abstract
Diyabet, pre-diyabet, alkolsüz yağlı karaciğer hastalığı (NAFLD) ve alkolsüz steatohepatit (NASH) gibi metabolik hastalıklar giderek yaygınlaşmaktadır. Ex vivo karaciğer perfüzyonları, titizlikle kontrol edilebilen beslenme koşullarında nükleer manyetik rezonans (NMR) kullanarak karaciğer metabolizmasının kapsamlı bir analizine izin verir. Siliko simülasyonları, hormon eylemlerini ve farmasötik müdahalenin etkilerini değerlendirmenin birincil teorik bir aracı olmaya devam ettiğinden, perfüze edilmiş karaciğer, hepatik metabolizmayı anlamak için en değerli test yataklarından biri olmaya devam etmektedir. Bu çalışmalar hepatik fizyolojiye ilişkin temel anlayışlara rehberlik ettiğinden, sonuçlar doğru ve tekrarlanabilir olmalıdır. Ex vivo hepatik perfüzyonun tekrarlanabilirliğinde en büyük faktör cerrahinin kalitesidir. Bu nedenle, in situ NMR deneyleri bağlamında ex vivo fare karaciğer perfüzyonlarını gerçekleştirmek için organize ve kolaylaştırılmış bir yöntem sunduk. Ayrıca benzersiz bir uygulamayı tanımlıyoruz ve bu çalışmalarda karşılaşılan ortak sorunları tartışıyoruz. Genel amaç, in situ NMR deneyleri bağlamında hepatik rezeksiyonlarda ve perfüzyonlarda tekrarlanabilir sonuçlar elde etmek için altın standart olarak gördüğümüz birkaç yıl boyunca rafine ettiğimiz bir tekniğe karmaşık olmayan bir rehber sağlamaktır. Mıknatıs için alanın merkezine olan mesafe ve NMR deneyi sırasında dokunun müdahaleye erişilememesi, yöntemlerimizi yeni kılmaktadır.
Introduction
Ex vivo perfüzyonlar hepatik metabolizma çalışmasında çok önemlidir ve portal ven yoluyla perfüzyon bu çalışmalar için standarttır. Hepatik metabolizmayı izole olarak incelemek için, diğer organlardaki metabolizmadan (yani tüm vücut metabolizması) kaynaklanan komplikasyonları önlemek ve hormon mevcudiyeti (insülin, glukagon vb.) üzerinde kontrol sağlamak için karaciğer vücuttan rezeke edilmelidir. Bu yaklaşım, diyabet, NAFLD ve NASH gibi hastalıkların hepatik metabolizma üzerindeki etkilerini ve ilaç etki mekanizmalarını anlamak için gerekli olabilir. Bu makale hepatik rezeksiyon ve perfüzyon için bir rehber niteliğindedir. Bu metabolik karaciğer çalışmalarını yeterli titizlik ve tekrarlanabilirlik ile gerçekleştirmek için kolaylaştırılmış bir prosedür geliştirdik. Ameliyat doğru yapılmazsa, elde edilen metabolik verilerde belirgin değişkenlik vardır. Literatür 1,2,3,4,5’te tanımlandığı gibi, nükleer manyetik rezonans (NMR) spektrometresinde in situ metabolik çalışmalar bağlamında portal ven kateterizasyonu ve karaciğer rezeksiyonu yapmak için organize bir yöntem tanımladık.
Şu anda, bir NMR içinde bir cam sütun kullanılarak ex vivo hepatik perfüzyonu tanımlayan bir literatür yoktur. Ayrıca, prosedürün fare karaciğeri ile nasıl gerçekleştirileceğine dair net bir örnek sunan, özellikle portal venin nasıl kateterize edileceğini, bir karaciğerin nasıl rezeke edileceğini, aktarılacağını ve karaciğerin bir cam sütuna nasıl asılacağını gösteren bir video veya metin yayını da yoktur. Genetiği değiştirilmiş fare, karaciğer metabolizmasını incelemek için her yerde kullanıldığından, bu tam bir açıklamayı hak eden önemli bir prosedürdür. Karaciğer perfüzyon ameliyatları yeni değildir, ancak bu makale, bu prosedürle ilgilenen herkese yardımcı olmak için bu makalede açıklanan teknik mükemmelliği gösteren bir video eşliğinde altın standart bir yöntemdir. Burada sunulan yöntem, hastalık modellerinde metabolitlerin işlevini ve döngüsünü tespit etmek için gerçek zamanlı metabolizmaya en iyi şekilde uygulanacaktır.
Bu yöntem, karaciğerin bir NMR tüpü içinde perfüzyonla kapsüllenmiş kanülün dibinde asılı kalmasını sağlayan 100 cm’lik su ceketli bir cam sütun kullanır. Cam ceket içindeki ısıtılmış su, perfüzyon sıcaklığını kontrol etmek için kullanılır. İnce tabakalı bir oksijenatör, pH kontrolü için% 95 / % 5 O 2 / CO2 ile basınçlandırılır. Üç ayrı pompa kullanılarak, karaciğere sabit basınç sağlayan perfüzyon kolon yüksekliği ayarlanır. Akış hızları, sabit basınç uygulamasının ötesinde kontrol edilmez (Şekil 1). Karaciğerin uygun şekilde çalıştığını doğrulamak için, oksijen ölçümleri akış hızları ile birlikte alınır. Ellerimizde, bu ön koşullar kümesi, karaciğer metabolik fonksiyonunun değerlendirilmesi için oldukça tekrarlanabilir NMR deneylerine yol açmaktadır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu cerrahi prosedür zordur ve tekrarlanabilir sonuçlar elde etmek için kapsamlı bir uygulama gerektirir. İzofluran ve taşıyıcı gaz, hayvanın yaşayabilirliğini cerrahi prosedürün mümkün olduğunca büyük bir kısmı boyunca korumak için gerektiği gibi ayarlanmalıdır. Çevre, günün saati, yaş, kilo ve diğer bazı faktörler anesteziyi etkileyecektir. Kilo, diyet, farelerin suşu ve yaş, yağ birikimi portal venin görselleştirilmesine müdahale edebileceğinden ameliyatı etkileyebilir. Pençeler…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüleri’nin (R01-DK105346, P41-GM122698, 5U2C-DK119889) finansmanıyla desteklenmiştir. Bu çalışmanın bir kısmı, Ulusal Yüksek Manyetik Alan Laboratuvarı’nın Ulusal Bilim Vakfı İşbirliği Anlaşması No tarafından desteklenen İleri Manyetik Rezonans Görüntüleme ve Spektroskopi (AMRIS) Tesisi’ndeki McKnight Beyin Enstitüsü’nde gerçekleştirildi. DMR-1644779 ve Florida Eyaleti.
Materials
| 1 mL Luer-Lock Single Use Sterile Disposable Syringe | N/A | N/A | Non-specific Brand |
| 100 cm Water Jacketed Glass Column | N/A | N/A | Custom Made |
| 2-0 Silk Suture | Braintree Scientific | N/A | |
| 22 Gauge Catherter 1 in. Without Safety | Terumo | SRFF2225 | |
| 23 G 0.75 in. Hypodemeric Needles | Exel International | 26407 | |
| 27 G 1.5 in. Hypodemeric Needles | Exel International | 26426 | |
| 4×4 in. Surgical Platform | N/A | N/A | Custom Made |
| 70% Alcohol Wipe | N/A | N/A | Non-specific Brand |
| Circulating Water Bath | MS Lauda | N/A | Model no longer manufactured |
| Cotton Tip Applicator | N/A | N/A | Non-specific Brand |
| Delicate Operating Scissors; Straight; Sharp-Sharp; 30mm Blade Length; 4 3/4 " | Roboz | RS-6702 | |
| Dumont #5/45 Forceps | Fine Scientific Tools | 11251-35 | |
| Dumont #7 – Fine Forceps | Fine Scientific Tools | 11274-20 | |
| Hemostats | Fine Scientific Tools | 13015-14 | |
| Heparin Sodium Injectable 1000 units/mL | RX Generics | 71288-0402-02 | |
| Isoflurane | Patterson Veterinary | 14043-0704-06 | |
| Lidocaine HCl 2% | VEDCO Inc. | 50989-0417-12 | |
| Membrane-Thin-Layer Oxygenator | Radnoti | N/A | |
| Metzenbaum Scissors; Curved; Blunt; 27 mm Blade Length; 5 " | Roboz | RS-6013 | |
| Oxygen Meter System | Hanstech Instruments Ltd. | N/A | |
| Saline 0.9% Solution | N/A | N/A | Saline is made in lab |
| Scale | N/A | N/A | Non-specific Brand |
| Variable Speed Analog Console Pump Systems | Cole Palmer | N/A | Models are custom per application |
| Weigh boats | N/A | N/A | Non-specific Brand |
References
- Ragavan, M., McLeod, M. A., Giacalone, A. G., Merritt, M. E. Hyperpolarized Dihydroxyacetone Is a Sensitive Probe of Hepatic Gluconeogenic State. Metabolites. 11 (7), 441 (2021).
- Lumata, L. Hyperpolarized (13)C Magnetic Resonance and Its Use in Metabolic Assessment of Cultured Cells and Perfused Organs. Methods in Enzymology. 561, 561-573 (2015).
- Moreno, K. X., et al. Real-time detection of hepatic gluconeogenic and glycogenolytic states using hyperpolarized [2-13C] dihydroxyacetone. The Journal of Biological Chemistry. 289 (52), 35859-35867 (2014).
- Moreno, K. X., et al. Hyperpolarized δ-[1-13C] gluconolactone as a probe of the pentose phosphate pathway. NMR in Biomedicine. 30 (6), (2017).
- Merritt, M. E., Harrison, C., Sherry, A. D., Malloy, C. R., Burgess, S. C. Flux through hepatic pyruvate carboxylase and phosphoenolpyruvate carboxykinase detected by hyperpolarized 13C magnetic resonance. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (47), 19084-19089 (2011).
- Bailey, L. E., Ong, S. D. Krebs-Henseleit solution as a physiological buffer in perfused and superfused preparations. Journal of Pharmacological Methods. 1 (2), 171-175 (1978).
- Kolwicz, S. C., Tian, R. Assessment of Cardiac Function and Energetics in Isolated Mouse Hearts Using 31P NMR Spectroscopy. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (42), e2069 (2010).
- Hwang, G. H., et al. Protective effect of butylated hydroxylanisole against hydrogen peroxide-induced apoptosis in primary cultured mouse hepatocytes. Journal of Veterinary Science. 16 (1), 17-23 (2015).
- Bessems, M., et al. The isolated perfused rat liver: standardization of a time-honoured model. Laboratory Animals. 40 (3), 236-246 (2006).
- Beal, E. W., et al. A Small Animal Model of Ex Vivo Normothermic Liver Perfusion. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (136), e57541 (2018).
- Collins, J. B., Song, J., Mahabir, R. C. Onset and duration of intradermal mixtures of bupivacaine and lidocaine with epinephrine. The Canadian Journal of Plastic Surgery. 21 (1), 51-53 (2013).
- . Medical Dictionary Available from: https://www.merriam-webster.com/medical (2022)
- Thorpe, D. R. . A Dissection in Color: The Rat (and the Sheep’s Brain). , (1968).
- Cabral, F., et al. Purification of Hepatocytes and Sinusoidal Endothelial Cells from Mouse Liver Perfusion. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (132), e56993 (2018).
- . Operations Manual Setup, Installation and Maintenance Available from: https://www.chem.ucla.edu/dept/Faculty/merchant/pdf/electrode_prep_maintenance.pdf (2006)
- . Heparin Available from: https://go.drugbank.com/drugs/DB01109 (2022)
- Overmyer, K. A., Thonusin, C., Qi, N. R., Burant, C. F., Evans, C. R. Impact of anesthesia and euthanasia on metabolomics of mammalian tissues: studies in a C57BL/6J mouse model. PloS One. 10 (2), 0117232 (2015).
