Drosophila Passives Vermeidungsverhalten als neues Paradigma zur Untersuchung assoziativen aversiven Lernens
Summary
Diese Arbeit beschreibt ein einfaches Verhaltensparadigma, das die Analyse des aversiven assoziativen Lernens bei erwachsenen Fruchtfliegen ermöglicht. Die Methode basiert auf der Unterdrückung des angeborenen negativen Geotaxis-Verhaltens aufgrund der Assoziation zwischen einem bestimmten Umweltkontext und einem elektrischen Schlag.
Abstract
Dieses Protokoll beschreibt ein neues Paradigma zur Analyse des aversiven assoziativen Lernens bei erwachsenen Fliegen (Drosophila melanogaster). Das Paradigma ist analog zum passiven Vermeidungsverhalten bei Labornagetieren, bei dem Tiere lernen, ein Kompartiment zu meiden, in dem sie zuvor einen elektrischen Schlag erhalten haben. Der Assay nutzt die negative Geotaxis bei Fliegen, die sich als Drang nach oben manifestiert, wenn sie auf einer vertikalen Oberfläche platziert werden. Das Setup besteht aus vertikal ausgerichteten oberen und unteren Fächern. Beim ersten Versuch wird eine Fliege in ein unteres Fach gelegt, aus dem sie normalerweise innerhalb von 3-15 s austritt, und tritt in das obere Fach, wo sie einen elektrischen Schlag erhält. Während des zweiten Versuchs, 24 h später, wird die Latenz deutlich erhöht. Gleichzeitig ist die Anzahl der Schocks im Vergleich zum ersten Versuch verringert, was darauf hindeutet, dass Fliegen ein Langzeitgedächtnis über das obere Kompartiment bildeten. Die Aufzeichnungen von Latenzen und Anzahl der Schocks könnten mit einem Zähler und einer Stoppuhr oder mit einem Arduino-basierten einfachen Gerät durchgeführt werden. Um zu veranschaulichen, wie der Assay eingesetzt werden kann, wurde hier das passive Vermeidungsverhalten von D. melanogaster und D. simulans männlich und weiblich charakterisiert. Der Vergleich der Latenzen und der Anzahl der Schocks ergab, dass sowohl D. melanogaster als auch D. simulans Fliegen das passive Vermeidungsverhalten effizient erlernten. Es wurden keine statistischen Unterschiede zwischen männlichen und weiblichen Fliegen beobachtet. Die Männchen waren jedoch beim Betreten des oberen Kompartiments im ersten Versuch etwas schneller, während die Weibchen in jedem Retentionsversuch eine etwas höhere Anzahl von Schocks erhielten. Die westliche Ernährung (WD) beeinträchtigte das Lernen und Das Gedächtnis bei männlichen Fliegen signifikant, während Flugübungen diesen Effekt ausgleichten. Zusammengenommen bietet das passive Vermeidungsverhalten bei Fliegen einen einfachen und reproduzierbaren Assay, mit dem grundlegende Mechanismen des Lernens und des Gedächtnisses untersucht werden können.
Introduction
Lernen und Gedächtnis ist ein evolutionär alter Anpassungsmechanismus an die Umwelt, der von Drosophila (D.) bis zum Menschen erhalten bleibt1. Die Fruchtfliege ist ein robuster Modellorganismus zur Untersuchung grundlegender Prinzipien des Lernens und des Gedächtnisses, da sie eine breite Palette leistungsstarker genetischer Werkzeuge zur Verfügung stellt, um intrinsische molekulare Mechanismen zu sezieren2. Die bahnbrechenden genetischen Screening-Studien, die Rutabaga3-, Amnesie4– und Dunce5-Gene identifizierten, die für Lernen und Gedächtnis entscheidend sind2, nutzten die olfaktorische Konditionierung, da die Fruchtfliegen auf ihren scharfen Geruchssinn angewiesen sind, um Nahrung und potenzielle Partner zu finden und Raubtiere zu vermeiden6.
Die olfaktorische Konditionierung ist dank der Einführung des olfaktorischen T-Labyrinths durch Tully und Quinn zu einem beliebten Paradigma geworden, um den Mechanismus des Lernens und des Gedächtnisses zu untersuchen7,8. Anschließend wurden andere Methoden zur Messung verschiedener Arten von Lernen und Gedächtnis vorgeschlagen, darunter visuelle Konditionierung9, Balzkonditionierung10, aversiver Phototaxis-Suppressionsassay11 und Wespenexpositionskonditionierung12. Die meisten dieser Assays haben jedoch ein komplexes Setup, das in einer Universitätswerkstatt speziell angefertigt oder über einen Anbieter erworben werden muss. Das hier beschriebene Paradigma basiert auf einem einfachen Verhaltenstest zur Untersuchung des aversiven assoziativen Lernens bei Fliegen, das mit wenigen verfügbaren Vorräten leicht zusammengesetzt werden kann.
Das beschriebene Paradigma entspricht dem passiven (oder hemmenden) Vermeidungsverhalten bei Labormäusen und Ratten, bei dem Tiere lernen, ein Kompartiment zu meiden, in dem sie zuvor einen elektrischen Fußschock erhalten haben13. Bei Muriden basiert das Verfahren auf ihrer angeborenen Vermeidung von hellem Licht und der Vorliebe für dunklere Bereiche14. Beim ersten Versuch wird das Tier in das helle Kompartiment gebracht, aus dem das Tier schnell austritt und in ein dunkles Kompartiment tritt, wo ein elektrischer Fußschlag abgegeben wird. In der Regel reicht ein einziger Versuch aus, um ein solides Langzeitgedächtnis zu bilden, was 24 Stunden später zu einer deutlich erhöhten Latenz führt. Die Latenz wird dann als Index für die Fähigkeit des Tieres verwendet, sich an den Zusammenhang zwischen dem aversiven Reiz und der spezifischen Umgebung zu erinnern15.
Diese Arbeit beschreibt ein analoges Verfahren unter Verwendung von D. als Modellsystem, das mehrere Vorteile gegenüber Nagetiermodellen bietet, darunter Kosteneffizienz, größere Stichprobengröße, das Fehlen einer regulatorischen Aufsicht und zugang zu leistungsstarken genetischen Werkzeugen16,17. Das Verfahren basiert auf einem negativen Geotaxis-Verhalten, das sich im Drang der Fliegen äußert, nach oben zu klettern, wenn sie auf einer vertikalen Fläche platziert werden18. Der Aufbau besteht aus zwei vertikalen Kammern. Beim ersten Versuch wird eine Fruchtfliege in ein unteres Kompartiment gelegt. Von dort aus tritt es normalerweise innerhalb von 3-15 s aus und tritt in das obere Fach, wo es einen elektrischen Schlag erhält. Während eines 1-minütigen Versuchs können einige Fliegen gelegentlich wieder in das obere Kompartiment eindringen, was zu einem zusätzlichen elektrischen Schlag führt. Während der Testphase, 24 h später, wird die Latenz deutlich erhöht. Gleichzeitig ist die Anzahl der Schocks im Vergleich zum ersten Tag verringert, was darauf hindeutet, dass Fliegen ein aversives assoziatives Gedächtnis über das obere Kompartiment gebildet haben. Die Latenz, die Anzahl der Schocks sowie die Dauer und Häufigkeit der Pflegeanfälle werden dann verwendet, um das Verhalten des Tieres und die Fähigkeit zu analysieren, die Assoziation zwischen dem aversiven Reiz und der spezifischen Umgebung zu bilden und sich daran zu erinnern. Die repräsentativen Ergebnisse zeigen, dass die Exposition gegenüber der westlichen Ernährung (WD) das passive Vermeidungsverhalten bei männlichen Fliegen signifikant beeinträchtigt, was darauf hindeutet, dass die WD das Verhalten und die Kognition der Fliege tiefgreifend beeinflusst. Umgekehrt linderte die Flugübung den negativen Effekt der WD und verbesserte das passive Vermeidungsverhalten.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die Vermeidung bedrohlicher Reize ist ein entscheidendes Merkmal des adaptiven Verhaltens bei verschiedenen Arten von C. elegance bis human32. Vermeidungslernverfahren, die typischerweise die Flucht vor einem aversiven Ereignis beinhalten, sind seit den 1970er Jahren häufig verwendete Verhaltensaufgaben, um Lern- und Gedächtnisprozesse bei Labornagetieren zu untersuchen13. Bei aktiven Vermeidungsverfahren folgt auf einen gleichgültigen Re…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Studie wurde in Teilen von NIH R15ES029673 (AKM) unterstützt.
Materials
| Bloomington Formulation diet | Nutri-Fly | 66-112 | Available from Genesee Scientific Inc., San Diego, CA |
| 1000 µL Blue tip | Fisher | NC9546243 | |
| 17 x 100 mm 14 mL polypropylene culture tube | VWR | 60818-689 | |
| Aduino-based Automatic Kontrol Module | In-house | AKM-007 | This unit is optional. Complete description, schematics, wiring diagram and a code are provided at the ECU Digital Market – https://digitalmarket.ecu.edu/akmmodule |
| Dual-Display 2-Channel Digital Clock/Timer | Digi-Sense | AO-94440-10 | https://www.amazon.com/Cole-Parmer-AO-94440-10-Dual-Display-2-Channel-Jumbo-Digit/dp/B00PR0809G/ref=sr_1_5?dchild=1&keywords=Dual-Display+timer+jumbo&qid=1627660660&sr= 8-5#customerReviews |
| Electronic Finger Counter | N/A | N/A | https://www.amazon.com/gp/product/B01M8IRK6F/ref=ppx_yo_dt_b_search_asin_title?ie=UTF8&psc=1 |
| Fisherbrand Sparkleen 1 Detergent | Fisher Scientific | 04-320-4 | |
| Fly mouth aspirator | In-house | Prepared as described in reference 19. | |
| Grass S88 stimulator | N/A | N/A | Could be replaced with any stimulator which can provide described parameters |
| Kim-wipes | Fisher Scientific | 06-666 | Kimberly-Clark Professional 34120 |
| Metal block for fly immobilization | In-house | 4 x 13 x 23.5cm aluminum block | |
| Nutiva USDA Certified Organic, non-GMO, Red Palm Oil | Nutiva | N/A | https://www.amazon.com/Nutiva-Certified-Cold-Filtered-Unrefined-Ecuadorian/dp/B00JJ1E83G/ref=sxts_rp_s1_0?cv_ct_cx=Nutiva+USDA+Certified+Organic%2C+non-GMO%2C+Red+Palm+Oil&dchild=1&keywords=Nutiva+USDA+Certified+Organic%2C+non-GMO%2C+Red+Palm+Oil&pd_rd_i=B00JJ1E83G&pd_ rd_r=f35e9d2f-afe4-44b6-afc2-1c9cd705be18&pd_rd_w= R3Zb4&pd_rd_wg=eUv1m&pf_rd_ p=c6bde456-f877-4246-800f-44405f638777&pf _rd_r=M94N11RC7NH333EMJ66Y &psc=1&qid=1627661533&sr=1-1-f0029781-b79b-4b60-9cb0-eeda4dea34d6 |
| Shock tube | CelExplorer | TMA-201 | https://www.celexplorer.com/product_detail.asp?id=217&MainType=110&SubType=8 |
| Stopwatch | Accusplit | A601XLN | https://www.amazon.com/gp/product/B0007ZGZYI/ref=ppx_yo_dt_b_search_asin_title?ie=UTF8&psc=1 |
| Transparent vinyl tubing (3/4” OD, 5/8” ID) | Lowes | Avaiable from Lowes |
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