Модель колотой раны тектума зрительного нерва взрослого человека с использованием рыбок данио-рерио и медаки для сравнительного анализа регенеративной способности

Summary

Описана модель механической черепно-мозговой травмы у взрослых рыбок данио-рерио для исследования молекулярных механизмов, регулирующих их высокую регенеративную способность. Метод объясняет создание ножевого ранения в тектуме зрительного нерва нескольких видов мелких рыб для оценки регенеративных реакций с использованием флуоресцентного иммуноокрашивания.

Abstract

В то время как рыбки данио-рерио обладают превосходной способностью к регенерации своей центральной нервной системы (ЦНС), медака имеет более низкую регенеративную способность ЦНС. Модель черепно-мозговой травмы была разработана в тектуме зрительного нерва взрослых рыбок данио-рерио и медаки, и были проведены сравнительные гистологические и молекулярные анализы для выяснения молекулярных механизмов, регулирующих высокую регенеративную способность этой ткани у этих видов рыб. Здесь представлена модель ножевого ранения для тектума зрительного нерва взрослого человека с использованием иглы и гистологических анализов на пролиферацию и дифференцировку нейральных стволовых клеток (НСК). Иглу вручную вводили в центральную область тектума зрительного нерва, а затем рыб интракардиально перфузировали, а их мозг рассекали. Затем эти ткани были криосекций и оценены с использованием иммуноокрашивания по соответствующим маркерам пролиферации и дифференцировки НСК. Эта модель тектумной травмы обеспечивает надежные и воспроизводимые результаты как у рыбок данио, так и у медаки, что позволяет сравнивать реакции NSC после травмы. Этот метод доступен для небольших телеостов, включая рыбок данио, медаку и африканских рыб-убийц, и позволяет нам сравнивать их регенеративную способность и исследовать уникальные молекулярные механизмы.

Introduction

Рыбки данио-рерио (Danio rerio) обладают повышенной способностью к регенерации центральной нервной системы (ЦНС) по сравнению с другими млекопитающими ^1,2,3. Недавно, чтобы лучше понять молекулярные механизмы, лежащие в основе этой повышенной регенеративной способности, был проведен сравнительный анализ регенерации тканей с использованием технологии секвенирования следующего поколения ^4,5,6. Структуры мозга у рыбок данио-рерио и четвероногих совершенно разные ^7,8,9. Это означает, что было разработано несколько моделей черепно-мозговых травм с использованием мелких рыб со схожими структурами мозга и биологическими особенностями, чтобы облегчить исследование основных молекулярных механизмов, способствующих увеличению регенеративной способности.

Кроме того, медака (Oryzias latipes) является популярным лабораторным животным с низкой способностью к регенерации сердца и нейронов^10,11,12,13 по сравнению с рыбками данио. Рыбки данио-рерио и медака имеют сходные структуры мозга и ниши для взрослых нейральных стволовых клеток (НСК)^14,15,16,17. У рыбок данио-рерио и медаки тектум зрительного нерва включает два типа НСК: нейроэпителиоподобные стволовые клетки и радиальные глиальные клетки (RGCs)^15,18. Ранее была разработана ножевая рана для тектума зрительного нерва взрослых рыбок данио, и эта модель была использована для исследования молекулярных механизмов, регулирующих регенерацию мозга у этих животных 19,20,21,22,23. Эта молодая взрослая модель ножевых ранений рыбок данио-рерио индуцировала регенеративный нейрогенез из RGC 19,24,25. Это ножевое ранение в тектуме зрительного нерва является надежным и воспроизводимым методом 13,19,20,21,22,23,24,25. Когда та же модель травмы была применена к взрослой медаке, низкая нейрогенная способность RGC в тектуме зрительного нерва medaka была выявлена с помощью сравнительного анализа пролиферации и дифференцировки RGC после травмы¹³.

Модели ножевых ранений в тектуме зрительного нерва также были разработаны в моделях^{мумихога 26}, но детали повреждения тектума не были хорошо задокументированы по сравнению с повреждением теленцефала²⁷. Ножевое ранение в тектуме зрительного нерва с использованием рыбок данио-рерио и медаки позволяет исследовать дифференциальные клеточные реакции и экспрессию генов между видами с дифференциальной регенеративной способностью. В этом протоколе описывается, как выполнить ножевое ранение в тектуме зрительного нерва с помощью инъекционной иглы. Этот метод может быть применен к мелким рыбам, таким как рыбки данио-рерио и медака. Здесь объясняются процессы подготовки образцов для гистологического анализа и анализа клеточной пролиферации и дифференцировки с использованием флуоресцентной иммуногистохимии и криосекций.

Protocol

Все экспериментальные протоколы были одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию в Национальном институте передовых промышленных наук и технологий. Рыбки данио-рерио и медака содержались в соответствии со стандартными процедурами28. <…

Representative Results

Ножевое ранение в тектуме зрительного нерва с помощью введения иглы в правое полушарие (рис. 1, рис. 4А и рис. 5А) индуцирует различные клеточные реакции, включая пролиферацию радиальных глиальных клеток (RGC) и генерацию нейронов новорожденн…

Discussion

Здесь описан набор методов, которые могут быть использованы для индуцирования ножевых ранений в тектуме зрительного нерва с использованием иглы для облегчения оценки пролиферации и дифференциации RGC после черепно-мозговой травмы. Игольчатые ножевые ранения представляют собой просто…

Materials

10 mL syringe	TERUMO	SS-10ESZ
1M Tris-HCl (pH 9.0)	NIPPON GENE	314-90381
30 G needle	Dentronics	HS-2739A
4% Paraformaldehyde Phosphate Buffer Solution	Wako	163-20145
Aluminum block			115 x 80 x 37 mm (W x D x H) is enough size to freeze 6 cryomolds
Anti-BLBP	Millipore	ABN14	1:500
Anti-BrdU	Abcam	ab1893	1:500
Anti-HuC	Invitrogen	A21271	1:100
Anti-PCNA	Santa Cruz Biotechnology	sc-56	1:200
Brmodeoxyuridine	Wako	023-15563
Confocal microscope C1 plus	Nikon
Cryomold	Sakura Finetek Japan	4565	10 x 10 x 5 mm (W x D x H)
Cryostat	Leica	CM1960
Danio rerio WT strains RW
Extension tube	TERUMO	SF-ET3520
Fluoromount (TM) Aqueous Mounting Medium, for use with fluorescent dye-stained tissues	SIGMA-ALDRICH	F4680-25ML
Forceps	DUMONT	11252-20
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 488	Invitrogen	A32723
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 546	Invitrogen	A11035
Hoechst 33342 solution	Dojindo	23491-52-3
Hydrochloric Acid	Wako	080-01066
Incubation Chamber for 10 slides Dark Orange	COSMO BIO CO., LTD.	10DO
MAS coat sliding glass	Matsunami glass	MAS-01
Micro cover glass	Matsunami glass	C024451
Microscopy	Nikon	SMZ745T
Normal horse serum blocking solution	VECTOR LABRATORIES	S-2000-20
O.C.T Compound	Sakura Finetek Japan	83-1824
Oryzias latipes WT strains Cab
PAP Pen Super-Liquid Blocker	DAIDO SANGYO	PAP-S
Phosphate Buffered Saline (PBS) Tablets, pH 7.4	TaKaRa	T9181
Styrofoam tray			100 x 100 x 10 mm (W x D x H) styrofoam sheet is available as tray
Sucrose	Wako	196-00015	30 % (w/v) Sucrose in PBS
Tricaine (MS-222)	nacarai tesque	14805-24
Trisodium Citrate Dihydrate	Wako	191-01785
Triton X-100	Wako	04605-250